БІОЛОГІЯ МОЛОЧНОКИСЛИХ БАКТЕРІЙ - Екологія та систематика

Виділення і класифікація молочнокислих бактерій з вин проведена в багатьох виноробних районах світу. Основний внесок у вивчення молочнокислих бактерій у вині зробили французькі дослідники: Peynot E., Ribero-Gayon J., Lafon-Lafourcade S., Domerc S., Sudro R. et al., чиї дослідження узагальнені Ribero-Gayon J. et al. [74]. Молочнокислі бактерії у вині вивчали Ранкін Б. і Форнашон Дж. [173] у винах Австралії, Россі І., Костаманья Л., Клементі Ф. [178] - в Італії, Маре Р. і Соцці [151,152] - у Швейцарії, Інграхам Дж., Вон Р., Кук Г. [135], Райс А. [175] - в Америці, Чалфен Дж., Голдберг І., Мательс Р. [104] - в Ізраїлі. У результаті встановлено, що в залежності від кліматичних умов і сорту вина з переважанням гомо- або гетероферментативної групи виділяють представників родів: Lactobacillus, Lenconostoc, Pediococcus. Джерелом молочнокислих бактерій у вині є виноград, заводське обладнання та комунікації.
У нашій країні цьому питанню приділено набагато менше уваги. Детальні дослідження з екології ЛАБ належать Е.І. Квасніков. та його учні [41,43]. Квасніков Є.І., Кондо Г.Ф. [42] встановили, що найбільшу загрозу виноробству в Центральній Азії становлять молочнокислі бактерії. При вивченні штамів, виділених з вин Середньої Азії і Казахстану, в порівнянні зі штамами, виділеними з різних природних субстратів, встановлена ​​їх ідентичність.
У винах Молдови визначення видового складу молочнокислих бактерій проводив Л.С. Юстратова. [32]. Автор зазначає, що в цій області найчастіше виділяють гомоферментативні палички, потім гетероферментативні, а гетероферментативні коки не зустрічаються. Однак у працях Кондо Г.Ф. [47] відзначили часту присутність гетероферментативних коків у винах Молдови.
Виділення на чисту культуру та таксономічне визначення молочнокислих бактерій з вірменських вин проводив Петян Е.О. [65] та Авакян Б.П. [1].
Рабінович З.Д. та Бур’ян Н.І. [70] визначили видовий склад молочнокислих бактерій у винах Криму, Гянджінського району Азербайджану та Одеської області. Виділені штами належали до гомоферментативних лакт-паличок.  plantarum, коки Pediococcus cerevisiae, гетероферментативні палички Lact. brevis і Lact buchneri, коки Leuconostos gracile і Leuc. oenos. Серед робіт, присвячених екології молочнокислих бактерій окремих виноробних районів СНД, слід відзначити дослідження Гогоберідзе Р.Г. [10] Грузинські вина і Журавльова В.П. та ін. [35] Туркменські вина. Іванова І.П. та Баштанної І.І. [38] при вивченні молочнокислих бактерій при виробництві шампанського пляшковим методом із 302 зразків готової продукції та виробничих приміщень виділено 100 штамів чистих культур молочнокислих бактерій, представлених переважно гомоферментативними коками (38 шт.) роду Streptococcus, гомоферментативними паличками (27 шт.) роду Streptococcus. Підрід Lactobacillus Streptobacterium, а також у невеликій кількості гетерококи (3 шт.) роду Leuconostoc та гетероферментативні палички (4 шт.) роду Lactobacillus підроду Betabacterium. Було показано, що концентрації етанолу та діоксиду сірки, які використовуються у виробництві шампанського, не обмежують розвиток молочнокислих бактерій.
Молочнокислі бактерії в іспанських винах під час їх приготування та зберігання описав Пардо Зуніга [162].
Класифікація молочнокислих бактерій дуже складна, що пов'язано з деякими особливостями цієї групи мікроорганізмів. По-перше, молочнокислі бактерії дуже широко поширені в природі в різноманітних місцях існування. Часто зустрічаються молочнокислі бактерії, окремі ознаки яких не характерні для всієї групи. По-друге, складність класифікації полягає в широкій мінливості багатьох властивостей цих мікроорганізмів, особливо при їх культивуванні в різних середовищах і в різних умовах. Серед молочнокислих бактерій часто зустрічаються штами, які не можна віднести до того чи іншого виду або підроду, а займають проміжне положення.
Детальний аналіз існуючих схем класифікації молочнокислих бактерій здійснено Е.І. Квасніков. та Нестеренко О.А. [43], Ribero-Guyon J. та ін. [74], Бур’ян Н.І. [5,6]. Загалом молочнокислим бактеріям у систематиці бактерій приділено настільки мало уваги, що важко знайти місце молочнокислим бактеріям у вині.
Молочнокислі бактерії, виділені з вин, відрізняються від LAB з інших середовищ існування своєю здатністю розмножуватися при низьких значеннях pH (2,6-3,2) в присутності спирту і в середовищі, досить бідному на поживні речовини.
Peynaud E. і Domercq S. [166] зазначають, що неможливо встановити класифікацію винних бактерій на основі таксономії бактерій іншого походження. Педерсон С. [164] виділив молочнокислі бактерії у вині в окрему групу, назвавши їх «неактивними бактеріями» через їх надзвичайно повільний ріст навіть на багатих поживними речовинами середовищах.
Роботи з класифікації виділених з вина бактерій досить численні, але вони не завжди засновані на великій кількості штамів. Пейно Е., Домерк С. [166] проаналізували існуючі приватні схеми класифікації з використанням 400 штамів і оцінили вагу використовуваних у них характеристик. Класифікація, яку вони пропонують, використовує схеми Vaughn R. et al. на гетерородах [74], Rogozy M. et al. [177], Рогозі М. і Шарп М. [176] про гомороди, Харві Е. [122,123] про лейконостоків і Накагава А. і Кітахара К. [74] про педіококи і базується головним чином на морфології клітин (паличок або коків), природі бродіння глюкози (гомо- чи гетеро-) і бродіння пентози - властивості який, згідно Peynaud, має особливе енологічне значення.
Таблиця 1.1. наведено класифікацію молочнокислих бактерій у вині на основі пентозної проби та лимонно-кислого бродіння [74]. Відповідно до екологічної класифікації існує два різновиди Lact. plantarum: гомоферментативні бактерії, які зброджують пентози і розкладають лимонну кислоту, і бактерії, які розкладають лимонну кислоту і не зброджують пентози. Ця характеристика видів бактерій зручна для практичного виноробства.
Розподіл коків і паличок за функціями пентозного бродіння виявився несподіваним і заслуговує на окрему увагу. Виявилося, що коки найчастіше можуть бути пентозонегативними або арабінозопозитивними. Коки, які зброджують ксилозу, зустрічаються у вині вкрай рідко. Ще рідше зустрічаються палички, які ферментують арабінозу. Також мало коків, які бродять одночасно пентози, і паличок, які не бродять. Протилежна поведінка коків і бацил по відношенню до ферментації пентоз виражає паралелізм, який існує між формою клітини і певними функціями бродіння.

Таблиця 1.1
Класифікація молочнокислих бактерій у винах згідно [74]

Закваска: А+ арабіноза; X+ ксилоза; Р+ пентози (арабіноза, ксилоза), С+ лимонна кислота.
Не ферментують: Р+ пентози (арабіноза, ксилоза); С-лимонна кислота.

Слід зазначити, що ще в першій класифікації Orl-Jensen S. [161] критерієм ідентифікації лактобацил служила ферментація арабінози та ксилози. Ферментація гексоз паличками часто слабо виражена і проявляє всі ступені ферментативної активності від одного штаму до іншого. Навпаки, пентози легше бродять і на цій основі легко класифікувати молочнокислі бактерії вина.
Пентозна проба є основою для диференціації з багатьох причин. По-перше, це уніфікує основу для класифікації паличок і коків. По-друге, ферментація пентоз бактеріями є єдиною яскраво вираженою ознакою бродіння, оскільки воно є стабільним, а не адаптивним. Нарешті, здатність трансформувати пентози представляє технологічний інтерес, оскільки це міра небезпеки бактеріальних змін. Однак значення пентозного тесту не виключає необхідності вивчення інших властивостей описаних молочнокислих бактерій.
У системі заходів біологічної стабілізації вин важливе місце займає створення умов для своєчасного проходження яблучно-молочного бродіння в висококислотних матеріалах і попередження молочнокислих процесів в інших видах вин. Для розробки рекомендацій щодо регулювання кислотності вин велике значення мають дані про екологію молочнокислих бактерій.
У період з 1972 по 1990 рік нами досліджено велику кількість виноматеріалів з різних регіонів Радянського Союзу на наявність молочнокислих бактерій. Молочнокислі бактерії всіх систематичних груп виділено в чисті лінії (табл. 1 і 2). Як видно, найбільш рідкісними представниками молочнокислої мікрофлори досліджуваних вин є представники роду Pediococcus. Вони зустрічалися один раз і при зберіганні показали знижену життєздатність, гинучи вже при перших пересівах.
Дещо частіше, але також відносно рідко, у досліджуваних винах зустрічаються гомоферментативні палички. Основним джерелом їх виділення були зразки хересного виноматеріалу з-під плівки. Виділення молочнокислих бактерій з хересу виявилося надзвичайно складним, незважаючи на їх майже постійну присутність під час процесу приготування хересу. Виділені гомороди були нежиттєздатними при зберіганні та швидко гинули в лабораторних умовах.
Найпоширенішими представниками молочнокислої мікрофлори у виноматеріалах досліджуваних регіонів є гетероферментативні палички та коки. При цьому простежується досить чіткий зв'язок між характером виділеної мікрофлори, видом виноматеріалу і кліматичним районом.
Ця теза простежується у виноматеріалах дуже контрастного в кліматичному відношенні Киргизстану. З різних видів виноматеріалів виділено близько 700 чистих ліній ЛАБ. При визначенні їх належності до біохімічної групи всі вони виявилися гетероферментативними [21].
Для ідентифікації відібрано 139 штамів, що відрізняються за морфологією. Аналіз морфокультуральних ознак досліджуваних молочнокислих бактерій дав змогу виділити 4 групи (табл. 1.3). Як видно з представлених даних, морфологія колоній була дуже різноманітною. Що здається цікавим, так це ізоляція дуже маленьких тонких паличок, які часто утворюють довгі нитки та кластери та дають слабкий ріст у рідкому середовищі.
Усі бактерії були нерухомі та нездатні до споруляції; вони росли при 15°C і не росли при 45°C.
Вивчення біохімічних властивостей дало змогу визначити видовий склад досліджуваних молочнокислих бактерій (табл. 1.4).

Таблиця 1.2
Молочнокисла мікрофлора різних виноматеріалів

 
Таблиця 1.3
Морфологічні та культуральні властивості молочнокислих бактерій

Представлений матеріал свідчить про переважне переважання в мікрофлорі киргизьких вин гетероферментативних паличок, причому паличок різної морфології. Найбільшу різноманітність спостерігали у молочнокислих бактерій яблучних соків. Інтерес представляло виділення бактерій виду Lact. hilgardii. У вітчизняній літературі відомостей про виявлення цього виду молочнокислих бактерій у вині ми не зустрічали, хоча зарубіжні дослідники вважають його звичайним для плодово-виноградних вин. Лакт. hilgardii виділені у великій кількості з винограду і частіше з хворих вин, ніж з вин яблучно-молочного бродіння. Однак цей вид вважається хорошим провідником яблучно-молочного бродіння, оскільки яблучна кислота зброджується ним при pH 3,0-3,2.

Таблиця 1.4
Видовий склад молочнокислої мікрофлори киргизьких вин за [166]

Позначення: Х+ ксилозопозитивний;
p+ пентоза позитивна.

Наявність цих бактерій у столовому виноградному матеріалі, а також гетероферментативних коків роду Leuconostoc свідчить про можливість спонтанного біологічного підкислення вин і створює передумови для регуляції їх кислотності.
Лакт. brevis і Lact. buchneri є найбільш технологічно небажаним видом. Вони майже завжди звільняються від хворих вин. Хороша стійкість до спирту і кислотності, здатність утилізувати пентози дозволяє цим бактеріям розвиватися у винах зі зниженим вмістом гексоз.

Виділення великої кількості цих бактерій повинно викликати тривогу і вимагає ретельного мікробіологічного контролю на всіх етапах приготування вина.
Систематичне положення визначено також у 33 штамів роду Leuconostoc, виділених з анапських і киргизьких вин (табл. 1.5). Під час ідентифікації особливу увагу звертали на ферментацію пентоз. Була також врахована характерна особливість бактерій роду Leuconostos - їх нездатність утворювати аміак з аргініну [166].
З 33 штамів лише 2 були віднесені до виду Leuconostoc oenos, решта 31 штам до виду Leuconostoc mesenteroides var. gracile.
Усі культури більшою чи меншою мірою залежно від інтенсивності росту були здатні до утворення СО2 з глюкози.
Наші результати цілком узгоджуються з думкою більшості дослідників про переважання гетероферментативних форм молочнокислих бактерій у винах, виготовлених у регіонах із жарким кліматом.

Таблиця 1.5
Видовий склад молочнокислих бактерій роду Leuconostoc

Умовні позначення: + наявність знака;
- відсутність ознаки