Товарів: 0
На суму: 0 грн
Незважаючи на численні дослідження біологічного зниження кислотності за допомогою молочнокислих бактерій, процес індукованого яблучно-молочного бродіння не завжди є успішним. Однією з причин збою яблучно-молочного бродіння є наявність бактеріофагів.
В даний час бактеріофагія фактично стала самостійним напрямком біології, теоретичне і практичне значення якого виходить далеко за межі мікробіології. Особливу групу мікроорганізмів становлять фаги: ультрамікроскопічні паразити бактерій, які за своїми біологічними властивостями близькі до вірусів тварин і рослин. Явище бактеріофагії широко поширене в природі. Останні наукові дані свідчать про те, що скрізь, де є мікроорганізми, є бактеріофаги.
Проблема бактеріофагії виявилася дуже актуальною для ряду виробництв, заснованих на використанні життєдіяльності мікроорганізмів, в яких в результаті фаголізу стали спостерігатися серйозні порушення технологічного процесу.
Виявлення присутності фагів для більшості відомих груп мікроорганізмів зумовлює необхідність враховувати явища фагії при роботі з мікроорганізмами.
Що стосується виноробства і, зокрема, молочнокислих бактерій у вині, то це питання має не тільки теоретичне значення як для проблеми фагії, так і для біології молочнокислих бактерій, але й практичний інтерес у зв'язку з роллю, яку відіграють молочнокислі бактерії в технологічному процесі.
Перше повідомлення про виявлення фагів у вині було зроблено Sozzi T. і Marais R. [191]. У винах на стадії яблучно-молочного бродіння виявлено три морфологічні типи фагів. Підкреслюється, що всі фаги були ідентифіковані в матеріалах, pH яких був нижче 3,5.
Подальші дослідження цього питання [190, 103, 125] привели авторів до думки, що труднощі яблучно-молочного бродіння вина пов'язані з атакою молочнокислих бактерій бактеріофагами. При цьому виділено два типи бактеріофагів з різною літичною здатністю Leuconostoc oenos [190].
Minarik E. [158], досліджуючи молоді швейцарські вина, показав, що наявність бактеріофагів пригнічує не тільки процес яблучно-молочного бродіння, викликаний додаванням чистої культури молочнокислих бактерій, але й кислотозниження, яке розвивається за рахунок спонтанної мікрофлори.
Gnaedji F. та ін. [126], Sozzi T. і Gnaedzhi F. [189] у широкому вивченні ролі бактеріофагів у процесах виноробства запропонували шукати стійкі до фага молочнокислі бактерії та готувати на їх основі закваски для яблучно-молочного бродіння.
Оскільки при роботі з фагом першорядне значення має отримання хорошого культурального газону на поверхні агарової пластинки та у зв’язку з винятково слабким ростом винних молочнокислих бактерій на твердих середовищах, була проведена робота з підбору оптимального складу живильного середовища.
Випробувані як стимулятори 8-гідроксихінолін (0,0012-0,0020%), іони натрію (0,025-0,25 М), аміак (0,0001 М), стрептоміцин (0,1-1,5 γ/см3) не впливали на формування колоній негативних фагів. Вважається, що ці речовини сприяють адсорбції фага на бактеріальній клітині та його внутрішньоклітинному розмноженню. Стрептоміцин, вибірково діючи на клітинні мембрани, сприяє проникненню фага в клітину.
Позитивні результати отримані при застосуванні іонів кальцію, які вносили в середовище у вигляді хлориду кальцію в дозі 0,1 М. Вивчення ряду поживних середовищ для отримання газону та виявлення на ньому фаголізу дозволило вибрати м’ясо-пептонний агар (МПА), який готували з додаванням хлориду кальцію (0,1 М) та екстракту дріжджів (0,5%).
Розробка методу звільнення культуральної рідини від бактерій включала аналіз таких методів, як центрифугування, фільтрація через фільтр Зейтца, обробка хлороформом.
Більшість методів вивчення фаголізу передбачає центрифугування при 4000 хв-1 протягом 20-40 хвилин. Отримані нами дані щодо стерильності центрифугатів молочнокислих бактерій, отриманих у різних умовах, показали непридатність цього методу. Після посіву на чашки з агаром усі центрифугати створювали масу невеликих склоподібних колоній. Очевидно, це пов'язано з особливостями розвитку гомоферментативних паличок. Спостереження за молодою культурою відзначили виражений поліморфізм: культура була представлена довгими тонкими нитками, сильно переплетеними, що містять масу коккоподібних тілець на кінцях ниток і у вільному стані. Надалі кількість кокових форм помітно зменшується. Очевидно, наявність таких дрібних форм перешкоджає повному осіданню молодої культури молочнокислих бактерій при центрифугуванні.
Згідно з дослідженнями фагів молочнокислих бактерій у молочній промисловості, видалення бактерій досягається шляхом фільтрації через фільтр Зейтца. Однак, за багатьма літературними даними, цей метод не рекомендується через значну адсорбцію фага фільтром, і чим нижча концентрація вірусу, тим більше його адсорбція, аж до повної втрати фага.
Вихід із ситуації було знайдено шляхом попередньої обробки фільтра м’ясним бульйоном або розчином желатину для насичення адсорбційної здатності фільтра білками [55].
Зручним і швидким методом видалення бактерій є обробка досліджуваного субстрату хлороформом [18], але він застосовний лише при роботі з нечутливими до хлороформу фагами. Через відсутність інформації про чутливість фагів молочнокислих бактерій до хлороформу цей метод можна було перевірити лише шляхом отримання достатньо активного фага.
Дослідження впливу хлороформу на молочнокислі бактерії та їх фаги з точки зору ефективного звільнення досліджуваного субстрату від бактерій показали, що 10-20-хвилинна обробка хлороформом повністю вбиває бактерії і не впливає на фаги. 30-хвилинна обробка дещо знижує активність фагофільтрату.
Отримані результати дозволили надалі застосовувати фільтрацію через фільтр Зейтца лише при отриманні фаголізатів з високим титром. Для звільнення досліджуваної на наявність фага рідини від бактерій використовували більш простий спосіб обробки хлороформом.
Робота з фагом передбачає використання культури в експоненціальній фазі росту, для виявлення якої були побудовані графіки росту двох штамів гомоферментативних паличок Lact. plantarum (К-8-4 і К-12-11). Досліджувані штами відрізнялися кінетикою росту. Логарифмічна фаза починалася через 14-15 годин після посіву і тривала 8 годин у штаму К-8-4 і 4 години у штаму К-12-11.
Дослідження кінетики росту молочнокислих бактерій роду Leuconostoc показало, що експоненціальна фаза починається через 22-24 години від моменту посіву і триває до 58-60 годин.
Виходячи з отриманих даних, у подальшій роботі використовували культуру роду Lactobacillus у віці 18-20 годин, а роду Leuconostoc – у віці 26-28 годин.
Проведено дослідження чутливості молочнокислих бактерій до УФ-опромінення з метою визначення оптимальної дози опромінення для ідентифікації індукованої фагопродукції. УФ-промені дозували, змінюючи час експозиції від 10 с до 1 хв. У літературі оптимальною дозою для фагової індукції є доза, при якій гине половина бактеріальної популяції. Вимірюючи бактеріальні суспензії до і після опромінення, вдалося встановити, що оптимальною дозою для досліджуваних бактерій можна вважати 30 секунд.
Оптимальний час інкубації опроміненої суспензії також було показано експериментально. 6-7 годин при температурі 28°С за умови висіву на солодове сусло у співвідношенні 1:100.
