Товарів: 0
На суму: 0 грн
Пластидні пігменти зелених рослин являють собою ту частину фотосинтетичного апарату, яка безпосередньо пов'язана з процесом фотосинтезу. Тому для глибокого пізнання цього процесу велике значення мають питання якісного і кількісного співвідношення пігментів.
Один із різновидів методу хроматографії — паперова хроматографія — незамінний інструмент у вивченні фотосинтетичних пігментів, їх якісному та кількісному розділенні та визначенні.
Дослідження пігментів пластид за допомогою паперової хроматографії включає наступні етапи роботи:
а) взяття середньої проби та фіксація матеріалу;
б) вилучення пігментів розчинниками та нанесення їх на хроматографічний папір;
в) поділ пігментів на хроматограмі;
г) елюювання пігментів, визначення їх концентрації та розрахунок вмісту пігментів.
Взяття середньої проби матеріалу. При взятті середньої проби необхідно мати на увазі, що вміст пігментів і їх співвідношення помітно змінюється в залежності від ряду зовнішніх факторів і внутрішніх умов. Тому для взяття середньої проби необхідно взяти таку кількість матеріалу, щоб можна було отримати достовірні результати. При відборі проб має значення, в якому вигляді мате або ріал подається на аналіз (свіжий або сухий). Матеріал зі свіжого листя відбирають в кількості 2-3 г (зазвичай з листя нарізають диски корковим свердлом певного діаметру). Великі порції свіжої рослинної сировини містять велику кількість води, тому при екстракції пігментів необхідно... переходити на більш концентрований розчинник (ацетон 90-100%). Свіжий матеріал необхідно зафіксувати ланцюгом інактивації ферменту. Фіксацію при високих температурах (90-100 С) краще проводити у фосфатному буфері рН 7-10, який використовують для нейтралізації кислот клітинного соку. Найкращим способом інактивації ферментів є фіксація при негативних температурах (мінус 35 - мінус 70), що досягається за допомогою охолоджуючих сумішей.
Екстракція пігментів розчинниками та нанесення їх на хроматографічний папір. Для повного вилучення пігментів матеріал подрібнюють у фарфоровій ступці з кварцовим піском або в гомогенізаторі. Якщо матеріал попередньо не закріплювався у фосфатному буфері, то при подрібненні до нього додають невелику кількість (на кінчику ножа) крейди, соди або карбонату магнію. Пігменти екстрагують із подрібненого матеріалу органічними розчинниками (спирт, ацетон, петролейний ефір, бензин). Найчастіше для добування пластидних пігментів використовують суміш етилового спирту й ацетону у співвідношенні 3:1; можливі й інші співвідношення цих розчинників, а також чистого спирту й ацетону. Після ретельного подрібнення матеріалу в ступці витяжку фільтрують через скляний фільтр № 2 у колбу. Осад на фільтрі два-три рази промивають тією ж сумішшю спирту й ацетону. Об'єм екстракту доводять у мірній колбі до 20-25 мл
Пігменти можна наносити на папір у будь-якому органічному розчиннику, а також у будь-якій їх суміші. Це пояснюється тим, що при висушуванні хроматограм в потоці повітря органічні розчинники випаровуються. Спосіб нанесення на папір залежить від вибору хроматограми.
Більш повне розділення пігментів відбувається на двовимірних хроматограмах з використанням кількох розчинників. Однак можна розділити лише невеликі кількості, оскільки вихідна суміш наноситься у вигляді невеликої плями. Для кількісних визначень краще використовувати одновимірні хроматограми, оскільки в цьому випадку екстракт наноситься у вигляді смужки на один кінець паперу. Стартова смужка наноситься максимально рівномірно, чим досягається більш ретельний поділ пігментів. Нижній край початкової смужки повинен бути на відстані не менше 2-3 см від нижнього краю паперу і не доходити до бічних країв паперу на 0,5-4 см. Об'єм нанесеного розчину залежить від його концентрації і від розміру аркушів паперу, які використовуються для хроматографії. Папір зміцнюють так, щоб нижній край був вільним. Тримаючи папір за куточок, піпеткою наносять розчин.
Розділення аугментів на хроматограмі (за методикою Сапожнікова Д.І. та ін., 1955). Кілька крапель екстракту наносять піпеткою на хроматографічний папір розміром 16х16 см на відстані 2 см від краю, одночасно підсушуючи до утворення яскраво-зеленої плями. Потім згорнутий у трубочку папір кладуть на дно циліндричної скляної посудини з притертою кришкою, у яку попередньо шаром 0,5 см наливають розчинник (суміш бензолу та петролейного ефіру у співвідношенні 3:1). Коли розчинник досягає майже верхнього краю паперу, хроматограму виймають і висушують у потоці повітря. На хроматограмі вище всіх пігментів розташований каротин, нижче — ксантофіл, ще нижче — частково розділені хлорофіли «а» і «б».
Щоб чітко розділити хлорофіли, хроматограму згортають у напрямку, перпендикулярному до першої, і знову поміщають у циліндричну посудину. Як розчинник використовують суміш етилового спирту і петролейного ефіру у співвідношенні 1:14. У цьому випадку відбувається повне відділення хлорофілів. Зверху розташований хлорофіл «а», знизу «б». Для кількісного визначення пігментів кожну пляму вирізають і розчиняють у відповідному розчиннику.
Поділ пігментів на одновимірній хроматограмі. Для поділу пігментів на одну сторону аркуша хроматографічного паперу за допомогою калібрувальної піпетки наносять строго відміряну кількість ацетонового екстракту пігментів. Розмір аркуша паперу залежить від скляних посудин, які використовуються для хроматографії. Екстракт наносять піпеткою у вигляді вузької смужки на відстані 2 см від краю. Після висушування в потоці повітря екстракт пігменту наносять на смужку ще кілька разів до утворення яскраво-зеленої смужки. Після цього папір занурюють у циліндр із розчинниками (суміш бензолу та петролейного ефіру у співвідношенні 3:1). На хроматограмі каротин і ксантофіл чітко відокремлені один від одного і від хлорофілів, але останні не повністю відокремлені. Для кількісного визначення пігментів такого розділення цілком достатньо, якщо проводити його на спектрофотометрі, де можна окремо визначити концентрацію хлорофілів «а» і «б» у розчині. Якщо необхідно розділити хлорофіли, то для виділення зелених пігментів використовують одновимірну хроматограму.
Хлорофіли «а» і «б» легко розділяються на папері в суміші петролейного ефіру і спирту в співвідношенні від 20:1 до 14:1. Величина встановлюється залежно від співвідношення компонентів і кількості пігментів, нанесених на хроматограму. На хроматограмі хлорофіл «а» розташований ближче до вершини, а хлорофіл «b» — ближче до початкової точки.
Тривалість хроматографії повинна бути достатньою для повного відділення пігментів один від одного. Однак, щоб запобігти розтікання смужок, не слід сильно збільшувати час хроматографії. Необхідно суворо стежити за ходом процесу і не допускати висихання верхньої частини хроматограми, оскільки це призводить до зміщення окремих пігментних смуг.
Елюювання пігментів з паперу. Після того, як пігменти розділені, хроматограму виймають із посудини і дають розчиннику випаруватися. Потім його розрізають на смужки відповідно до положення окремих пігментів. Кожну смужку нарізають невеликими шматочками і поміщають в маленькі склянки. Пігменти елююють сумішшю спирту з ацетоном у співвідношенні 3:1. Для кращого вимивання пігментів папірці попередньо змочують кількома краплями етилового спирту. Пігмент змивають з паперу декількома порціями суміші спирту з ацетоном, обережно перемішуючи скляною серветкою. Окремими порціями суміші розчинників заливають через лійку в мірну колбу і доводять до певного об'єму - від 5 до 25 мл. Об'єм елюату повинен бути таким, щоб концентрація пігментів була достатньою для визначення його за допомогою оптичних приладів.
Пігменти кількісно визначають за допомогою концентраційного колориметра, фотоелектроколориметра, а найбільш точно — спектрофотометра. Отримані дані дозволяють розрахувати концентрацію пігментів без калібрувальних кривих, грунтуючись на експериментах з оптичною щільністю і значеннями молярного або специфічного коефіцієнта екстинкції, відомих для кожного пігменту при відомій довжині хвилі.
На практиці для масових визначень пігментів широко використовують фотоелектроколориметр; з меншим успіхом застосовують концентраційні колориметри Кол-1.
