Методи фізіолого-біохімічних досліджень - Методи вивчення жирового обміну у винограді та фруктах

Жири є одним із важливих компонентів протоплазми живих рослинних клітин. Вони використовуються і накопичуються як запасні поживні речовини, особливо в репродуктивних органах: насінні та плодах. Вегетативні частини рідко містять більше 5%; зазвичай вміст жиру коливається в межах 2-3%. Кора містить більше жиру, ніж деревина. Найбільшу кількість жирів виявлено у флоемі та мозкових променях гілок. Коріння містять сліди жиру. Велика кількість їх виявлено в нирках в період спокою.
У більшості рослин спостерігаються сезонні коливання вмісту жиру: взимку його кількість збільшується, а влітку – зменшується. Так, Генкель і Окніна (1848), Ульріх та ін. (1961) показали, що під впливом низьких негативних температур жири накопичуються в тканинах рослин, а деякі дослідники пов'язують зникнення крохмалю взимку з накопиченням жирів. Муромцев, Локонова та ін (1961) відзначають, що клітини, позбавлені жиру, легше пошкоджуються холодом. Іванов (1946), Макнейр (1843) показали, що холод впливає не тільки на кількість жирів, а й змінює їх якість: відбуваються глибокі зміни в складі жирів, збільшується кількість ненасичених жирних кислот, Штумпф та ін. (1962), навпаки, в дослідах по синтезу жирів за допомогою мітохондрій виявили, що відносно низькі температури призводять до накопичення насичений fatty acids. жирні кислоти. Таким чином, виявлення закономірностей перетворення жирів у пагонах плодових рослин під впливом холоду є надзвичайно важливою ланкою обміну речовин при вивченні проблеми зимостійкості.
Протягом м'якої зими 1962/63 і надзвичайно суворої зими 1963/64 (для Вірменії) ми провели мікрохімічне і хроматографічне дослідження жирового обміну деяких плодових культур (персиків, абрикосів і винограду). Для виконання цієї роботи ми розробили схему.

на папері, змоченому гасом (230-260°); розділення різних жирних кислот на папері, змоченому вазеліном; розділення ненасичених кислот на папері, просоченому вазеліном.
Залежно від мети дослідження можливе дослідження тільки вільних або зв'язаних жирів або обох фракцій разом. Для цього потрібно провести відповідне вилучення. Подальші дослідження складових компонентів жирів вже проводяться загальною методикою на екстрактах зв'язаних і вільних жирів.
Вільна екстракція жиру. Відважують 10 г порошку в картриджах з фільтрувального паперу в склянках Сокслета. Екстракцію проводять протягом 12 годин в апараті Сокслета петролейним ефіром на водяній бані. Згущену витяжку кількісно з петролейним ефіром переносять у мірну колбу на 100 мл з притертою пробкою і зберігають у холодильнику для подальшого аналізу.
Екстракція зв'язаного жиру. Звільнений від вільних жирів матеріал у склянках Сокслета висушують у вакуум-апараті при 33 С. Потім його гідролізують протягом 12 годин спиртом (95 %) у тому ж апараті Сокслета на закритій електроплитці. Після цього спирт переганяють на 1/4 ємності і доливають сірчаним ефіром до попереднього об'єму. Тепер екстрагують протягом 12 годин сумішшю сірчаного ефіру і спирту (3: 1). Спиртово-ефірний розчинник відганяють, екстракт на дні колби піддають повторній екстракції петролейним ефіром. Усі порції промивної рідини фільтрують через скляний фільтр № 1 у мірні колби на 100 мл і зберігають у холодильнику до аналізу.
Хімічні методи дослідження

  • . Визначення сирого жиру (роль ефіророзчинної фракції).

    • У конічну колбу на 50 мл з притертою пробкою відбирають 20 мл екстракту, висушують у вакуум-сушарці при 20-30°С* і зважують на аналітичних вагах.
    % сирого жиру
    за сухою вагою
    де а - маса колби і сухого залишку, г;
    б               - маса колби, г;
    N - weight, g;
    Б - вологість, %.

  • . Визначення вільних жирних кислот. They take
  • мл екстракту сушать у вакуум-сушарці при 20-30°С. Залишок розчиняють в 5 мл теплого етилового спирту і в присутності однієї краплі індикатора нільського блакитного (0,1%) титрують 0,01 н. aOH в атмосфері азоту. Відсоток вільних кислот (у розрахунку на олеїнову кислоту) розраховується наступним чином:


    • де а – мл 0,01 н. МаОН,
    х - вільні жирні кислоти (на суху масу),%.

  • Визначення тригліцеридів. Наберіть 5 мл петролейного ефірного екстракту в пляшку об'ємом 25 мл, висушіть у вакуумній сушарці при 20-30 С, додайте 5-7 мл ацетону, перемішайте паличкою до повного розчинення речовини, поставте в холодильник з морозильною камерою на 1 годину. Потім фільтрують у мірну колбу на 50 мл і доводять петролейним ефіром до мітки. З I цього розчину відберіть у пробірку з притертою пробкою 10 мл. Розчинник випарюють у вакуумній сушарці при 20-30 С.

    • Одночасно в цій же пробірці випарюють 1 мл стандартного розчину тримкристину (1 мг/1 мл).
    В обидві пробірки заливають по 3 мл спиртоефірного розчинника (3:1). Після розчинення залишку додають 1 мл розчину гідроксиламіну, 0,4 мл розчину хлорного заліза, через 20 хвилин додають 0,6 мл 4 н. HCl, злегка перемішують. Додають 1 мл спиртоефірного розчинника і вимірюють на звичайному фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 520 мм.
    Реагенти. 1. Спиртово-ефірний розчин (3 частини спирту, 1 частина ефіру) збовтати і зберігати в холодильнику.

  • Розчин гідроксиламіну (розчин А) - 13,0 г гідроксиламіну гідрохлориду розчиняють дистильованою водою і доводять до 100 мл.

    • Розчин Б – 14,0 г NaOH розчиняють у 50 мл води і доводять об’єм до 100 мл.
    Перед використанням розчини А і Б змішати в рівних об’ємах.

  • Розчин НС 4 н. - 1 мл концентрованої НС&, 2 мл води.
  • Тримкристин стандартний розчин - 1 мг на
  • ml. Розрахувати за формулою:


    • де х - мг тригліцеридів в 1 мл екстракту в петролейному ефірі,
    C1 - оптична щільність (за червоною шкалою фотометра) досліджуваного розчину,
    С2 - оптична густина стандартного розчину.
    Щоб перетворити тригліцериди у відсоток сухої ваги, потрібно скористатися рівнянням

    де Н – маса екстрагованої речовини, г;
    B - humidity, %,
    x - mg. тригліцеридів в 1 мл петролейного ефірного екстракту.

  • Визначення фосфоліпідів. 5 мл нафтової витяжки упарюють у колбі К'єльдаля на 50 мл або 100 мл на водяній бані, 5 мл суміші сірчаної та азотної кислот (1:1) і піддають вологому спалюванню. Коли рідина в колбі стане прозорою, обережно доливають 30 мл дистильованої води (у колбу вкидають шматочки капіляра) і випаровують воду, поки пари не зникнуть запаху нітратної кислоти. Після спалювання рідину переносять у мірну колбу на 100 мл. Туди ж додають 20 мл розчину молібдену амонію і 20 мл відновника. Одночасно в тій же колбі до 3 мл стандартного розчину додають 10 мл сульфатної кислоти (3:1), 20 мл розчину молібдену амонію і 20 мл відновника. Обидві колби закупорюють і поміщають в термостат при 30-40 С на годину, потім колориметрують на фотометрі (ФЕК-56, фільтр 9) за довжини хвилі 630 мм.

    • Reagents. 1. Стандартний розчин - 0,3833 г KH2PO4 розчиняють в 1 л дистильованої води (одна-дві краплі толуолу захищають розчин від цвілі). В 1 мл цього розчину міститься 0,08732 мг фосфору (3 мл стандартного розчину містить 0,251,96 мг фосфору).

  • Розчин молібдену амонію - 25 г реактиву (х.д.) розчиняють в 1 л дистильованої води. Зберігати в темній пляшці з притертою пробкою.
  • Розчин відновника в 100 мл дистильованої води розчиняють 1 г гідрохінону, 15 г бісульфату.


    • де С 1 - концентрація фосфору в досліджуваному розчині (червоні цифри на фотометрі);
    С2 – концентрація фосфору в стандартному розчині.
    Крім того, % фосфоліпідів за сухою масою дорівнює

  • Iodine number. У конічну колбу з сухим залишком наливають 2,5 мл хлороформу, який використовують для визначення жиру-сирцю, який розчиняє залишок на дні та стінках колби. Закрити пробкою і залишити на 20 хвилин, потім додати 3 мл розчину Гануса, закрити колбу пробкою і поставити в темне місце на 1,5 години. Потім додають 5 мл 20% розчину йоду К, 10-20 мл води і титрують гіпосульфітом (n/10) при безперервному струшуванні в присутності 1% розчину крохмалю.

    • Для внесення поправок на розчини проводять сліпий експеримент без жирового екстракту. Розрахувати за формулою:

    де А 1 – витрата мл гіпосульфіту натрію на контрольну пробу;
    А2 - витрата мл гіпосульфіту натрію на дослідну пробу;
    Р—маса жирової речовини.
    Хроматографічні методи дослідження жирів

  • Розділення моно-, ди-, тригліцеридів на тонкому шарі кремнієвої кислоти (М.А. Муромцев, В.І. Локонова, 1961) Використовується спеціальна кремнієва кислота для хроматографії - 200 меш. Якщо немає, то можна використовувати хімічно чисту кремнієву кислоту після подрібнення в дрібний порошок (0,1 мм), який активують протягом 24 годин при 120 С. Для нанесення шару 3 мм на скло (9х16 см) необхідно мати 60 г кремнієвої кислоти та 1,2 г медичного гіпсу. Кремнієву кислоту і гіпс змішують у фарфоровій ступці, відразу ж додають 50 мл води і знову перемішують. Потім поступово додайте ще 30 мл оди (всього 80 мл). Цю суміш можна наносити на скло різними способами. Шар на склі сушиться близько 12 годин спочатку при кімнатній температурі, потім 3 години в шафі при 120 С.

    • У пробірку об'ємом 10 мл набирають 2 мл вихідного екстракту в петролейному ефірі, відганяють розчинник у вакуум-сушарці при 20-30 С, додають 1 мл ацетону і поміщають пробірку в холодильну камеру на 1 годину. З розчину ацетону використовують 0,25-0,5 мл (приблизно 1500-3000 гамма), який наносять на 2 см від нижнього краю склянки, покритої соєю. Хроматографують за висхідним двостадійним методом. Для цього використовуйте 2 батарейних відсіку 20x10x10 см. Першу стадію хроматографії проводять протягом приблизно 35 хвилин у суміші петролейного ефіру, сірчаного ефіру та оцтової кислоти (90:10:1). Другий етап - після висушування хроматограми при кімнатній температурі протягом 20 хвилин знову в суміші петролейного ефіру сірчаного ефіру та оцтової кислоти (40:60:1). Хроматограмму висушують при кімнатній температурі. Проявку проводять у парах йоду при 60 . Для ідентифікації гліцеридів одночасно з досліджуваним розчином наносять моно-, ди- і тригліцеридні маркери.

  • Розділення різних тригліцеридів на папері, змоченому в гасі (230-260). Tapes (4x28 cm or 3x28 cm) of chromatographic slow paper are immersed in a 5% acetone solution of kerosene, then lightly dried in air. Змочені папірці вставляють між двома склянками, 2 мл нафтового екстракту конденсують у вакуумі до 0,5 мл і зразок наносять на стартову лінію на відстані 2,5 см від нижнього краю паперу. Хроматографію проводять у спеціальних циліндрах діаметром 5 см і довжиною у висхідному потоці 25 см. The solvent is a mixture of 30 ml of glacial acetic acid and 70 ml of acetone saturated with kerosene (230-260). Для кожної хроматограми використовуйте 5 мл цього розчину. Перегонку проводять приблизно 12 годин при 20 С. Після цього стрічки промивають спочатку дистильованою водою, потім водопровідною і сушать 5-10 хвилин при 50-70 С. Хроматограмми занурюють на 1 хвилину в розчин чорного судану (70% спиртовий розчин, насичений чорним суданом). After draining, the chromatographic tapes are repeatedly immersed in 50% ethyl alcohol to clarify the background.
  • Розділення жирних кислот на папері, просоченому вазеліном. Take 5 ml of petroleum extract in a 20 ml test tube. Ефір відганяють у вакуумі при 20-30°С. Add 5 ml of 95% ethanol and add capillary pieces. Занурити на 10 хв у киплячу водяну баню, потім додати 2 мл спиртового лугу (до 10 г КОН додати 20 мл води; від цього розчину взяти 5 мл, змішати з 75 мл етилового спирту) і залишити пробірки у ванні до відгонки рідини. After cooling, the residue is acidified with 1 ml of sulfuric acid solution. Прогрійте ще 20 хвилин. Cool and add 15 ml of benzene, close the test tube with a ground stopper and shake vigorously for 30 minutes. Для хроматографії використовують бензольний шар.

    • Необхідно попередньо обробити папір. Для цього крізь смужки паперу для повільної хроматографії розміром 3х30 см низхідним потоком пропускають 50 % оцтову кислоту, потім сушать і висхідним потоком просочують 7-10 % бензольним розчином чистого вазелінового масла. After benzene evaporates in air, the test samples (about 1500 mg of fatty acids) are applied to paper 3 cm from the bottom edge. Chromatography is carried out in an upward flow with a mixture of acetic acid (98%)? мурашиної кислоти (85%) і води (75:25:2,5).
    The stepwise method of ascending chromatography can also be used to obtain tail-free collected spots. The first step is carried out with 90% acetic acid and 85% formic acid (3:1); second stage - 98% acetic and 85% formic acid (3:1). Після висушування хроматограму промивають дистильованою водою і занурюють на 30 хвилин у насичений розчин нітрату вісмуту, потім знову промивають водою і занурюють у 0,2% розчин Na2S. The resulting stains are compared with a fatty acid tracer.

  • Separation of unsaturated fatty acids on paper impregnated with petroleum jelly. Роботу проводять, як у розділі 3. Хроматограми проявляють 0,1% розчином KMnO4 протягом 1,5 хв, після чого переносять у кювети і промивають водою. Brown spots of unsaturated acids are obtained on a white background.

    • Chromatograms of various triglycerides and fatty acids can be subjected to quantitative measurements using a densitometer.















    Ще почитати:

    Міжнародні відносини о найменуванні шампанського та хереса

    В чому різниця між шампанським, просеко та ігристим вином?

    Отримання червоних ігристих вин пляшковим способом з винограду перспективних сортів

    Ігристі вина

    Токайські вина

    У нашому блозі «Приватна Марка» багато цікавого контенту: новинки ринку виноробства, крафтові рецепти наших технологів, влоги на різні теми. Дистиляція, крафтові винокурні, виробництво крафтового сидру, крафтовий квас, рецептура сидру, виробництво крафтових напоїв за нашими рецептами, виробництво спирту в промислових масштабах. Це та багато іншого цікавого у блозі «Приватна Марка Україна» та мережі магазинів «Винороб».

    Наприклад, ви вирішили відкрити сироварню, ковбасний цех або почати пекти крафтовий хліб — welcome! Ми завжди допоможемо: надамо рецептуру, забезпечимо всі витратні матеріали, відправимо нашого технолога, складемо технологічну карту, встановимо все обладнання, сертифікуємо виробництво, відкриємо для вас завод з нуля, виноробні, цехи, виноградники, налагодимо готовий продукт із виходом на ринок. Ми — компанія повного циклу: маємо багато представництв по всьому світу. Потрібна склотара, склобанки, медичний посуд, лабораторний посуд чи лабораторне обладнання — звертайтеся! У наших складах понад 900 тис. найменувань товарів та обладнання. Звертайтеся, не вагайтеся! Не важливо, де ви знаходитесь — у СНД, Європі, Америці чи Азії: ми маємо великий досвід. Privatna Marka йде в ногу з технологіями та інноваціями. Ми 20 років на ринку та відправили понад 1 млн посилок своїм клієнтам. Втілили багато креативних проєктів. Відкрили низку підприємств харчової промисловості, а також у непродовольчій та продовольчій групах технічних виробів. Втілили 147 комерційних проєктів у країнах СНД. Виробляємо 70 видів продукції власного виробництва в Україні, Німеччині та Китаї. У блозі ще більше цікавого та корисного.

    Консультації за тел. +380 (67) 440-70-90
    https://privatnamarka.com/
    https://www.instagram.com/privatnamarka?igsh=MWt0NzNxbHJrbXh4ZQ==\
    https://www.facebook.com/Privatnamarka
    https://youtube.com/@privatnamarkacom?si=P5RH_spetEP3x_RQ\