Повторна ідентифікація штамів дріжджів Saccharomyces з Національної колекції мікроорганізмів

Н.І. Бур’ян, доктор технічних наук, професор, провідний науковий співробітник відділу мікробіології,
Кяшковська С.А., доктор технічних наук, професор, завідувач кафедри мікробіології науки,
В.А. Загоруйко, д.т.н., проф., чл.-кор. НААН, заст.дир. для наукової роботи (виноробство),
Т.К. Скорікова, старший науковий співробітник відділу мікробіології,
Є.В. Іванова, к.б.н., старший науковий співробітник відділу мікробіології,
Черноокова Т.В., молодший науковий співробітник відділу мікробіології
Національний інститут винограду і вина «Магарач»

ПЕРЕТЕНТИФІКАЦІЯ ДЕЯКИХ ШТАМІВ САХАРОМІЦЕТНИХ ДРІЖДЖІВ З НАЦІОНАЛЬНОЇ КОЛЕКЦІЇ МІКРООРГАНІЗМІВ ДЛЯ ВИНОКУЛАРСТВА СУЧАСНИМИ МЕТОДАМИ АНАЛІЗУ

Наведено результати реідентифікації деяких промислово цінних культур дріжджів Національної колекції мікроорганізмів для виноробства (НКМВ) класичними та молекулярними методами аналізу. Експериментально підтверджено видову приналежність винних дріжджів, раніше ідентифікованих за систематикою Кудрявцева як Saccharomyces vini та Saccharomyces oviformis, до виду Saccharomyces cerevisiae.

Звичайними та молекулярними методами переідентифіковано низку культур дріжджів, що мають енологічну цінність, що зберігаються у національній колекції мікроорганізмів Інституту «Магарач». Винні дріжджі, раніше ідентифіковані як Saccharomyces vini і Saccharomyces oviformis за систематикою Кудрявцева, були віднесені до виду Saccharomyces cerevisiae, що підтверджено експериментально.

Ключові слова:таксономія, дріжджі Saccharomyces, бродіння, цукри, електроферограми, полімеразна ланцюгова реакція.

При виборі чистих культур дріжджів для виробництва того чи іншого сорту вина, як відомо, важливо знати їх вид.
Основну кількість дріжджів Saccharomyces, включених до Національної колекції мікроорганізмів для виноробства (НКМВ) і наданих підприємствам за їх заявками, визначено за таксономією В.І. Кудрявцева [1] як Saccharomyces vini із зазначенням їх синонімів згідно з систематикою під редакцією Лоддера [2]. Це пояснюється тим, що довгий час в СРСР ця систематика вважалася найбільш прийнятною для класифікації дріжджів у виноробстві. У цій систематиці одноклітинні гриби розглядаються автором як досить відокремлена таксономічна група аскоміцетів, об’єднаних у самостійний ряд Unicellomycetales [3]. Залежно від наявності та типу статевого процесу дріжджі поділяють на три підрозділи вищих грибів: аскоміцети, базидіоміцети та недосконалі. Поділ дріжджів на сімейства і роди здійснено за такими ознаками, як спосіб вегетативного розмноження, тип статевого процесу і форма аскоспор. У ньому, що особливо цінно для прикладної мікробіології, крім морфологічних і фізіолого-біохімічних характеристик враховується також спорідненість видів до певних умов існування та їх пристосування до цих умов. Тому вибір систематики за В.І. Кудрявцев на той час був цілком виправданий.
Сучасні уявлення про таксономію та систематику дріжджів детально викладено в ряді зарубіжних публікацій: Lodder, 1994, 1970 [2], Kregervan-Rij, 1984 [4], Kurtzman, 1998, 2003 [5, 6]. Систематика дріжджів роду Saccharomyces неодноразово переглядалася на основі різних комбінацій морфологічних, фізіологічних і біохімічних властивостей. Наприклад, винні дріжджі, відомі в старій літературі як Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces vini, Saccharomyces oviformis, зараз класифікуються як S. cerevisiae або S. bayanus. Пивні дріжджі, раніше відомі як Saccharomyces carlsbergensis і Saccharomyces uvarum, були перейменовані на S. cerevisiae або S. pastorianus.
В даний час рід Saccharomyces включає дріжджі, у яких вегетативна фаза переважно диплоїдна. Аскоспори кулясті або еліпсоїдні з гладкою стінкою, від однієї до чотирьох в аскусі.

Таблиця 1
Види роду Saccharomyces за Курцманом |5|

Примітки: «+» - позитивна реакція; «-» - негативна реакція; «р» - змінна реакція.

Стійкий до асцидозу. Види дріжджів роду Saccharomyces характеризуються круглими, овальними або еліптичними клітинами, які розмножуються брунькуванням. Характерною особливістю роду Saccharomycetes є зброджування гексозних цукрів, але типи зброджених або асимільованих цукрів відрізняються залежно від виду дріжджів [7].
Дріжджі Saccharomyces cerevisiae, які широко використовуються в науці і практиці, стали першим еукаріотичним організмом, для якого визначена повна нуклеотидна послідовність його геному [8].
В даний час систематики намагаються побудувати класифікацію, яка б відображала генетичну спорідненість між видами і родами дріжджів. За результатами секвенування домену D1/D2 гена 26S рРНК (близько 600 п.н.) у типових культурах понад 600 видів аскоміцетних дріжджів [6] створено комп’ютерну базу даних, за допомогою якої визначено таксономічне положення нових штамів. За деякими даними, після перегляду таксономії за допомогою молекулярної діагностики до роду Saccharomyces увійдуть лише види S. bayanus, S. cerevisiae, S. kudriavzevii, S. mikatae, S. paradoxus, S. pastorianus і, можливо, S. uvarum [9, 10].

Метою даного дослідження було уточнення видової приналежності деяких промислово цінних штамів дріжджів Saccharomyces колекції НКМВ за сучасною систематикою.
Для цього використовували як класичні методи, засновані на здатності мікроорганізмів зброджувати цукри (табл. 1), так і молекулярно-геноспецифічні, засновані на полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР). Видовими дослідними культурами були наступні штами, що зберігаються в НКМВ і люб’язно надані Г.І. Наумов. (Таблиця 2).
Бродіння цукрів проводили в трубках Данбара, як описано в книзі Н.І. Бур’ян [10].
Результати представлені в табл. 3, з якого випливає, що, крім двох штамів, усі виділені культури за таксономією Курцмана можна віднести до виду Saccharomyces cerevisiae. Що стосується двох штамів, то труднощі, що виникають при повторній ідентифікації, можуть бути пов'язані з їх особливим місцем у систематиці винних дріжджів за Кудрявцевим. Так, штам Jerez 20-C належить, згідно з систематикою Кудрявцева, до малого підвиду Saccharomyces oviformis var cheresiensis. Другий штам, Новоцимлянська-3, єдиний представлений у табл. 3, є представником виду Saccharomyces uvarum.
У таблиці 4 наведені синоніми винних дріжджів за сучасною таксономією Курцмана, підтверджені нами експериментально.
Таким чином, повторна ідентифікація штамів дріжджів Saccharomycetes класичним методом підтвердила паспортні дані про їх видову приналежність та відповідність синонімів систематиці Курцмана для більшості сільськогосподарських культур.
Для підтвердження видової приналежності штамів дріжджів генетичними методами ми використали аналіз поліморфізму довжини фрагментів рестриктази некодуючих ділянок рДНК (аналіз RFLP). Види роду Saccharomyces відрізняються послідовностями внутрішніх транскрибованих спейсерів ITS1 та ITS2 рДНК і можуть бути диференційовані на основі аналізу довжин рестрикційних фрагментів цієї ділянки. Використовуючи праймери p ITS 1 і p ITS4, ви можете ампліфікувати фрагмент, що включає 5.8S рДНК і спейсери ITS1 і ITS2 (5.8S-ITS фрагмент).

Таблиця 2
Видові дослідні культури дріжджів роду Saccharomyces

Таблиця 3
Переідентифікація колекційних культур дріжджів за їх здатністю зброджувати цукри (за Курцманом)

Примітка: P - змінна величина; * - визначення виду потребує уточнення.

Розмір ампліфікованих фрагментів 5.8S-ITS стандартний для всіх видів роду Saccharomyces і становить 850 п.н. для проставки ITS1.
В якості контролю використовували видотестери S. cerevisiae, S. bayanus, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae, S. paradoxus
Ідентифікація сахароміцетів складалася з двох етапів:

На рис. представлена ​​електроферограма продуктів ампліфікації транскрибованого спейсера рДНК ITS1 (за наявності специфічних праймерів (pITS 1/pITS 4)) культур дріжджів різних родів, що зустрічаються у виноробстві. З 13 штамів, представлених на ферограмі, вісім належали до роду Saccharomyces, решта належали до родів Schizocaccharomyces, Candida, Pichia, Hansehula та Brettanomyces.
Усі штами Saccharomyces при ампліфікації транскрибованого спейсера рДНК ITS1 (у присутності специфічних праймерів p ITS 1/ p ITS4) дали стандартний для цього роду фрагмент рДНК розміром 850 п.н.

Таблиця 4
Видові назви дріжджових культур за двома систематиками

Усі штами робочої колекції дріжджів Saccharomyces, на відміну від представників інших родів (Candida, Pichia, Hansenula, Brettanomyces, Shizosaccharomyces), при ампліфікації транскрибованого спейсера рДНК ITS1 у присутності специфічних праймерів p ITS 1/p ITS4 дали стандартні фрагменти розміром 850 п.н., що однозначно підтвердило їх приналежність до рід Saccaromyces.
Таким чином, ампліфікація транскрибованого спейсера рДНК ITS1 (за наявності специфічних праймерів p ITS 1/ p ITS4) може слугувати загальним тестером для ідентифікації виноробних дріжджів при аналізі дикої мікрофлори.
Ефективність рестриктазного аналізу ампліфікованих ділянок ITS рДНК у видовій ідентифікації дріжджів видів Saccharomyces. cerevisiae було підтверджено наявністю чотирьох фрагментів рДНК рестриктази для всіх проаналізованих штамів, що відповідає 325 bp, 230 bp, 170 bp. і 125 п.н., характерні для виду S. cerevisiae (табл. 5).
Таким чином, методи ПЛР-аналізу, використані нами при переідентифікації промислово цінних культур із колекції НКМВ, підтвердили видову приналежність винних дріжджів видів S.vini та S.oviformys (за систематикою Кудрявцева) до виду S.cerevisiae за сучасною систематикою Курцмана. Цей метод аналізу можна рекомендувати для мікробіологічного моніторингу видової чистоти процесів бродіння на даній культурі.
Автори висловлюють велику вдячність подружжю Наумових за допомогу в освоєнні методів ПЛР-аналізу, які ми використовували в роботі.

Рис. Електроферограма продуктів ампліфікації транскрибованої спейсерної ITS1 рДНК: М-маркер молекулярної маси; 1- тест-культура 401 (S. cerevisiae); 2-тест-культура 403 (S. bayanus); 3, 4, 6, 8, 9, 10 - дріжджі Saccharomyces відповідно, штами Steinberg; 47-К; каберне 5; Херес 20-С; Новоцимлянська 3; Ленінградська; 5- штам дріжджів schizosaccharomyces КП-1; 7- Candida; 11-Пічія; 12- Ганзенула; 13- Бреттаноміцети.

Таблиця 5
Рестрикційний аналіз ПЛР-ампліфікованих фрагментів некодуючих ділянок рДНК дріжджів SACCHAROVIYCF.S

Ще почитати:

Міжнародні відносини о найменуванні шампанського та хереса

В чому різниця між шампанським, просеко та ігристим вином?

Отримання червоних ігристих вин пляшковим способом з винограду перспективних сортів

Ігристі вина

Токайські вина

У нашому блозі «Приватна Марка» багато цікавого контенту: новинки ринку виноробства, крафтові рецепти наших технологів, влоги на різні теми. Дистиляція, крафтові винокурні, виробництво крафтового сидру, крафтовий квас, рецептура сидру, виробництво крафтових напоїв за нашими рецептами, виробництво спирту в промислових масштабах. Це та багато іншого цікавого у блозі «Приватна Марка Україна» та мережі магазинів «Винороб».

Наприклад, ви вирішили відкрити сироварню, ковбасний цех або почати пекти крафтовий хліб — welcome! Ми завжди допоможемо: надамо рецептуру, забезпечимо всі витратні матеріали, відправимо нашого технолога, складемо технологічну карту, встановимо все обладнання, сертифікуємо виробництво, відкриємо для вас завод з нуля, виноробні, цехи, виноградники, налагодимо готовий продукт із виходом на ринок. Ми — компанія повного циклу: маємо багато представництв по всьому світу. Потрібна склотара, склобанки, медичний посуд, лабораторний посуд чи лабораторне обладнання — звертайтеся! У наших складах понад 900 тис. найменувань товарів та обладнання. Звертайтеся, не вагайтеся! Не важливо, де ви знаходитесь — у СНД, Європі, Америці чи Азії: ми маємо великий досвід. Privatna Marka йде в ногу з технологіями та інноваціями. Ми 20 років на ринку та відправили понад 1 млн посилок своїм клієнтам. Втілили багато креативних проєктів. Відкрили низку підприємств харчової промисловості, а також у непродовольчій та продовольчій групах технічних виробів. Втілили 147 комерційних проєктів у країнах СНД. Виробляємо 70 видів продукції власного виробництва в Україні, Німеччині та Китаї. У блозі ще більше цікавого та корисного.

Консультації за тел. +380 (67) 440-70-90
https://privatnamarka.com/
https://www.instagram.com/privatnamarka?igsh=MWt0NzNxbHJrbXh4ZQ==\
https://www.facebook.com/Privatnamarka
https://youtube.com/@privatnamarkacom?si=P5RH_spetEP3x_RQ\