Товарів: 0
На суму: 0 грн
УДК 631.1:631.524.85.
БІОТЕХНОЛОГІЯ ГЕНЕТИКО-СЕЛЕКТИВНОГО ВИКОРИСТАННЯ МУТАНТІВ СМОРОДИНИ
В Д. Лукін
Державна наукова установа Всеросійський науково-дослідний інститут генетики і селекції плодових рослин ім. І.В. Мічуріна, Мічурінськ
Дослідження мутантів є одним із шляхів вивчення генетики ознак і отримання нових морфологічних типів. Вивчено шляхи використання мутантів у селекції нових форм садових рослин. Особливу увагу приділено використанню здатних до реверсії генних мутантів, які дають змогу отримувати генотипи з широким діапазоном прояву ознак дослідних рослин.
У тридцятих роках 19 ст. Н. Бор писав про можливість використання принципів атомної фізики в аналізі елементарних біологічних структур і явищ. Суть ідеї полягає в тому, що в області елементарних біологічних явищ можна зустріти таку ж подвійність, як і в квантовій фізиці. Принцип двоїстості вказує на максимум того, що можна встановити на досліджуваному об'єкті у разі незастосовності класичних методів.
Наприклад, неможливо передбачити, у якого з тих самих макроособей виникне мутація, яка послужить вихідним мікробіологічним явищем для цілого ланцюга макробіологічних процесів в онтогенезі вихідної форми. Іншими словами, при взаємодії іонізуючих частинок з генами неможливо точно й однозначно передбачити, чи відбудеться мутація в певному гені після відповідного опромінення. В результаті енергетичної дії ген може переходити з однієї відносно стабільної молекулярної структури в іншу. При цьому одні знаки можуть бути замінені іншими. Мутації є дискретними, оскільки існує кінцева кількість спадкових варіацій. Це вказує на те, що відмінності в алелях визначають стани складових молекул. Оскільки кількість можливих структурних змін у даній молекулі є кінцевою та обмеженою, такою ж має бути й кількість алелів. На практиці число алелей завжди менше через обмеження варіаційних можливостей летальним ефектом і втратою здатності до конваріантної редуплікації. Часто спостерігається безперервна мінливість ознак пов'язана з модифікуючим впливом середовища. Наявність дискретних груп серед живих організмів є відображенням квантової природи будови речовини.
Таким чином, суть мутаційного процесу полягає в переході генетичної інформації з одного квантового стану в інший. Квантова невизначеність зростає зі збільшенням дози опромінення, коли крива доза-вплив має не експоненціальну, а сигмоподібну форму, яка модифікується багатьма факторами і не може бути однозначно інтерпретована з позицій теорії мішеней.
Перевага щодо критичних і сублетальних доз ґрунтується на наступному: високі дози мутагену викликають більше мутацій, тому для їх виділення потрібно аналізувати менше матеріалу. Основне заперечення проти високих доз полягає в тому, що високі дози часто викликають численні мутації в одній клітині. Проти цього можна висунути такі заперечення. Результуюча швидкість мутації істотно не збільшується, а іноді навіть зменшується. Наявність ідентичних мутацій у клітинах малоймовірно, тому збереження або втрата будь-якої конкретної мутації мало залежить від загальної частоти мутацій і від дози мутагену. Там, де необхідно максимально зберегти генотипову специфічність вихідної форми, оптимальна доза опромінення повинна бути в 2-3 рази нижчою за критичну.
На Міжнародному симпозіумі з експериментального мутагенезу 1977 року була прийнята класифікація мутацій, згідно з якою всі типи мутацій можна розділити на три основні категорії.
Генні мутації діляться на два великі класи. До першого класу
включають пов'язані із заміною основи. Мутації другого класу викликані зсувом рамки зчитування. Останні включають вставки або делеції однієї або кількох пар нуклеотидів. На заміни основ припадає не більше 20% мутацій; більшість інших мутацій виникають в результаті делецій і вставок.
Існує два типи нуклеотидних замін - транзиції і трансверсії. Переходи передбачають заміну одного пурину іншим пурином або одного піримідину іншим піримідином. Радіація викликає цей тип заміни в 30% випадків. При трансверсії пурин змінюється на піримідин або навпаки. Для визначення генних мутацій використовуються такі критерії: відсутність цитологічних відхилень; гетерозиготна сегрегація нормальна, найчастіше моногібридна; здатність повертатися. Слід зазначити, що реверсії завжди були критерієм відсутності недоліків у даному гені. Однак тепер добре відомо, що фенотиповий ефект, подібний до зворотної мутації, може бути викликаний появою супресорних мутацій в інших локусах.
Серйозною перешкодою для використання мутантів у практичній селекції є плейотропія. Мутант, у якого багато ознак було змінено і тільки одна чи дві ознаки мають селекційну цінність, а решта є небажаними, не можна безпосередньо використовувати як предка нового сорту. Такі мутанти доцільно використовувати в схрещуваннях з іншими сортами і формами. В іншому генотиповому середовищі індивідуальні особливості плейотропного комплексу можуть змінювати свою експресію. Часто негативні ознаки затихають. Фенотипова експресія, тобто експресивність мутантного гена, може змінюватися залежно від умов середовища. Це пояснюється тим, що мутанти є новими генотипами порівняно з вихідними формами і відрізняються від останніх не тільки морфологічними ознаками, але й нормою реакції на умови навколишнього середовища.
Вивчення впливу різних типів мутацій в гомо- і гетерозиготному стані на розвиток організму пов'язане з моногібридним гетерозисом (ефект наддомінування). Теорія наддомінування базується на міжалельній комплементації. Зміни забарвлення листя у мутантів пов'язані не тільки з порушенням біосинтезу пігментів, а й зі змінами біосинтезу амінокислот, вітамінів, електротранспортного ланцюга фотосинтезу, білково-ліпідного комплексу.
Важливою особливістю індукованих мутацій рослин є рецесивний характер успадкування. Про це свідчать роботи, проведені на різних культурах. Значно рідше трапляються домінантні та напівдомінантні мутації у рослин. Випадки появи домінантних мутацій описані в небагатьох дослідженнях. Домінантні та напівдомінантні мутації частіше виникають у поліплоїдів і рідше у диплоїдів.
Мутації з'являються в окремих клітинах, але щоб їх виявити, зміни повинні торкнутися хоча б весь пагін. Необхідно, щоб з клітини-мутанта виникла тканина, з якої потім буде побудований відросток. Найбільш інтенсивно відбувається ріст тканини з опромінених бруньок, які менше пошкоджуються, а мутантні тканини через повільний ріст займають лише певний сектор або сегмент пагона. Кінцева мета - отримати втечу, що повністю складається з мутованих клітин.
Принцип роботи з ідентифікацією мутацій полягає в тому, щоб викликати зростання якомога більшої кількості додаткових або сплячих бруньок. Для цього пагони плодових культур обезголовлюють, тобто зрізають верхівку пагона. Ця операція викликає розвиток цих бруньок і ріст бічних пагонів. Серед цих пагонів починається відбір. Особливо часто мутації піддаються нижні пагони. Однак найчастіше для визначення мутації необхідно виконати описану операцію кілька разів послідовно. Пагони нарізають на живці, укорінюють або прищеплюють у крону дерева, потім обезголовлюють, викликаючи ріст бічних пагонів, які знову зрізають.
Отримання соматичних мутацій у плодових культур представляє особливо великий практичний інтерес, оскільки вони мають складну генетичну природу і високий ступінь гетерозиготності. Тільки опромінення в цьому випадку дає можливість змінити лише одну ознаку, не впливаючи на інші ознаки сорту. В даний час в області експериментального мутагенезу склалися два основних напрямки роботи:
За сучасними уявленнями генні мутації - це зміни на рівні нуклеотидів ДНК, які не зачіпають білкову складову нуклеопротеїну і не порушують цілісність хромосоми при їх утворенні. Генні мутації, викликані опроміненням, утворюються за більш короткий проміжок часу і менш залежні від різних внутрішньоклітинних процесів, у тому числі репараційних, ніж хромосомні перебудови. Відомо, що радіаційний мікромутагенез у вищих еукаріот
ініціюється первинним пошкодженням цитозинвмісних димерів, головним чином в області унікальних базових послідовностей ДНК. У справжніх рецидивуючих мутантів ферментативні властивості вихідного гена повністю відновлюються, завдяки тому, що у них виправлені зміни в структурі ДНК. Мутації, при яких ферментативні властивості повністю відновлюються, але структура ДНК гена залишається зміненою, називають супресорними мутаціями. Розрізняють два класи супресорних мутацій: прямі інтрагенні та непрямі екстрагенні, механізм дії яких абсолютно різний.
При прямих внутрішньогенних супресорних мутаціях пошкодження ДНК, викликане первинною мутацією, залишається невиправленим, але відбуваються вторинні зміни ДНК, які майже або повністю відновлюють ферментативні властивості білка, синтез якого контролюється цим геном. При непрямих екстрагенних супресорних мутаціях супресорна мутація виникає не в гені, в якому виникає первинна мутація, а в зовсім іншому, і пошкодження, викликані первинною мутацією, не коригуються, а обходяться. Цей обхід зазвичай здійснюється на рівні білків-ферментів шляхом збільшення кількості або підвищення активності тих білків-ферментів, з якими взаємодіє білок-фермент, синтез якого порушений первинною мутацією.
Мутантний генофонд є матеріальною основою для розвитку як теоретичних досліджень, так і практичної селекції рослин. Генні мутації створюють величезну спадкову мінливість господарсько-корисних і біологічних ознак (продуктивність, поживність, стійкість до несприятливих умов). Багато мутантів є джерелами цінних генів, які контролюють важливі ознаки. Використання в селекції унікальних мутантних форм дозволить перейти до створення нових морфобіологічних типів.
Існує два основних шляхи селективного використання штучних мутацій: пряме використання та використання мутацій у процесі гібридизації. У першому випадку стоїть завдання удосконалити існуючі сорти за певними ознаками. Метод прямого використання мутацій призначений для швидкого створення вихідного матеріалу з потрібними характеристиками та властивостями. Однак пряме і швидке використання мутацій, враховуючи високі вимоги до сучасних сортів, не завжди дає позитивні результати. Вихідний матеріал, отриманий в результаті мутагенезу, повинен, як правило, пройти гібридизацію - це другий спосіб використання штучних мутацій. Мутації можуть змінювати свій фенотипічний прояв залежно від того, до якого генотипу вони включені. Особливо це стосується генних мутацій. Тому схрещування якісно змінює вплив окремих мутацій на розвиток багатьох ознак і властивостей.
Експериментальний мутагенез також використовується разом з віддаленою гібридизацією. Шляхом штучних мутацій в окремих випадках вдається подолати несхрещуваність різних віддалених видів рослин, а також здійснити трансплантацію шляхом переміщення окремих хромосомних локусів диких видів у хромосомний комплекс культурних рослин. При дії випромінювання можлива відносно швидка зміна таких характеристик, які важко модифікувати.
Найважливішою проблемою сучасної генетики є створення генотипів, стійких до несприятливих факторів зовнішнього середовища, з високою врожайністю та якістю продукції. Відомо, що стійкість, як правило, пов'язана з домінантними ознаками, а кількість і якість продукції - з рецесивними. Однак поєднання таких домінантних і рецесивних ознак в одному сорті є складним завданням, що потребує використання великої кількості рослин у процесі селекції. Відбір мутантів, індукція ревертантів і генетичний аналіз їх ознак - це лише початок роботи з розробки методів отримання нових форм рослин.
Оцінити мутагенну активність зовнішнього середовища легше за допомогою біоіндикатора багаторічної рослини. Його було отримано шляхом опромінення живців екологічно стійкого виду смородини американської критичними дозами гамма-опромінення та подальшого клонального відбору генотипів, чутливих до наявності мутагенів у середовищі. Біоіндикатор можна використовувати в лабораторних умовах для оцінки мутагенної дії фізичних факторів і хімічних речовин; у містах, селищах та присадибних ділянках як декоративний кущ та індикатор наявності мутагенів у навколишньому середовищі за тестом на зворотні мутації (поява пагонів з великим листям); у сільській місцевості як екологічно оздоровча культура, що усуває водну та вітрову ерозію ґрунту навколо інтенсивно обробітку. Перевагою запропонованого біоіндикатора є можливість проведення тривалого моніторингу, не модифікованого тимчасовими випадковими коливаннями рівня недиференційованих мутагенів у навколишньому середовищі.
