Товарів: 0
На суму: 0 грн
УДК 581.143.6 + 581.165.1
БІОТЕХНОЛОГІЯ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ НАСІННЯ ОРХІДЕЙ ТА ПРОТОФУДУ
Г. Л. Коломєйцева Головний ботанічний сад ім. Н.В.Цицина, Москва Т.В.Нікішина, Е.В. Попова, А.С. Попова Інститут фізіології рослин ім. К.А. Тімірязєва РАН, Москва
Масове розмноження декоративних сортів і клонів, а також збереження рідкісних і зникаючих видів орхідей ex situ потребує застосування біотехнологічних методів, серед яких найбільш значущими є насіннєве та мікроклональне розмноження in vitro та створення кріобанків для тривалого зберігання насіння, меристем і протокормів.
Орхідеї - красиві і корисні трав'янисті рослини, які здавна використовуються як в декоративному садівництві, так і у фармакології, а останнім часом і у виробництві жіночих капелюшків і туалетів. У той же час сімейство орхідних може служити прикладом великого таксону квіткових рослин, багато представників якого є рідкісними і занесені до Червоних книг і міжнародних списків видів, що охороняються. Тому нині успішно розробляються біотехнологічні методи їх насіннєвого та мікроклонального розмноження, які, з одного боку, сприяють збереженню природних популяцій рідкісних видів, а з іншого – дозволяють ширше впроваджувати орхідеї в промислове виробництво та садівництво як лікарські та декоративні рослини. Таким чином, вони вже стають галуззю сільського господарства.
Шляхами збереження генофонду рідкісних та ендемічних видів орхідних в штучних умовах ex situ можуть бути: - створення колекцій живих рослин [1,2]; -створення банків зародкової плазми у вигляді насіння, меристем, пилку, клітинних культур, культур тканин та іншого генетичного матеріалу [3-8].
Масове насіннєве розмноження орхідей традиційним способом (посів на ґрунтові субстрати) мало доцільно через облігатний симбіотрофізм початкових етапів їх проростання, тому насіннєве розмноження представників цієї родини здійснюють переважно в асимбіотичній культурі in vitro на поживних середовищах. В останні роки насіння орхідей погано проростає. Застосовано екологічний підхід, за допомогою якого вдалося подолати фазу біологічного спокою в насінні багатьох орхідей помірної зони та посушливих регіонів Землі, спричинену інгібіторами, локалізованими в насіннєвій оболонці. Для цього використовували висів недозрілого насіння, видалення інгібіторів спеціальними розчинами, утримання посівів і сходів в умовах, максимально наближених до реально існуючих у природі (низькі температури взимку, недолік світла) [9, 10].
Коли насіння орхідей пророщують у культурі in vitro, а розсаду, що розвивається, згодом пересаджують у нове середовище, часто відбувається мимовільний відбір. Вибір особин для подальшого культивування визначається фенотиповими особливостями та залежно від цілей дослідника. Це можуть бути поодинокі протокорми, які швидко переходять до гемморизогенезу, або конгломерати протокормів з додатковими меристематичними центрами, здатними до повторного брунькування, або аморфні калюсоподібні тіла, які повільно ростуть у культурі протягом багатьох років.
Виділення з посіву маточників рослин з певним фенотипом неминуче призводить до збіднення генотипу в цілому, і чим довше зберігається відібрана з гетерогенного посіву популяція, тим більш однорідною вона стає. Особливо часто можна зустріти дегенеруючу популяцію орхідей in vitro при відборі на максимальну продуктивність на етапі формування протокорму. Чим довше така популяція підтримується в культурі in vitro, тим менш життєздатними стають регенеровані рослини, отримані з неї.
Таким чином, відкладення ex situ рідкісних орхідей у вигляді живих колекцій протокормів і калюсних культур неминуче призводить до виродження гетерогенних популяцій. В якості альтернативного способу збереження генофонду орхідей, як рідкісних і зникаючих рослин, ми досліджували можливість тривалого збереження насіння та протокорму в кріобанку за температури рідкого азоту.
Зрілі насіння орхідей за своєю природою ідеально підготовлені до тривалого зберігання в рідкому азоті. Вони мають погано диференційований ембріон, який часто складається лише з кількох клітин, мають початкову низьку вологість, малий розмір (250-1500 мкм в довжину, 270-990 мкм в ширину), тонку сітчасту оболонку насіння і майже повну відсутність ендосперму [11].
У роботі використовували зріле насіння, пророщене на агаризованому безгормональному живильному середовищі (1/2 МС) у темряві при 25-26 °С. Насіння заморожували в поліетиленових ампулах, швидко занурюючи в рідкий азот. Зберігається в кріобанку
7-30 днів. Ампули розморожували у воді при 41°С протягом 30 с. Протофіди заморожували в пластикових соломинках (діаметр 2, довжина 132 мм) після обробки розчинами для завантаження та склування. Останній використовувався PVS2PEg - {розчин вітрифікації рослин 2): 30% гліцерин + 15% PEG-6000 + 15% диметилсульфоксид (ДМСО) + 13,7% сахароза. Соломку також розморожували у воді протягом 2-5 с. Після розморожування та відмивання від PVS2 протокорми культивували протягом 180 днів у швидкому середовищі [12] при 23 ± 1 °C при освітленні: 8000 люкс, 16 год/добу. Результати представлені в таблицях 1, 2.
Таблиця 1
Характеристика насіння та його проростання до та після кріоконсервування
Переглянути | Вологість насіння, % | Кількість насіння без зародків, % | Довжина насіння, мкм | Довжина ядер, мкм | Схожість насіння на 30 добу, % | |
КОНТРОЛЬ | досвід (за ЛН) | |||||
Dactylorhiza fuchsii (Druce) Soo | 7,92 | до 50 | 750-1000 | 150-200 | 36.2 | 44.1 |
Dactylorhiza incarnata (L.) Soo | 7.51 | до 30 | 750-1000 | 200-250 | 14.1 | 26.7 |
Dactylorhiza maculata (L.) Soo |
| до 10 | 750-1000 | 200-250 | 71.1 | 42.1 |
Dactylorhiza baltica (Klinge) Orlova |
| до 20 | 1000 | 150-200 | 33.1 | 44.7 |
Platanthera bifolia (L.) Rich. | 9.5 | до 50 | 500-1000 | 150 | 33,0 | 16.0 |
Phaius flavus (Bl.) Lindl. | — | до 20 |
| 200-250 | 50,0 | 60.2 |
Calanthe sylvatica (Thou.) Lindl. |
| до 10 | 700 | 100 | 60.8 | 60,0 |
Примітка: ЛН - рідкий азот.
Характеристика протокорм Dactylorhiza fuchsii Soo та їх зростання до та після кріоконсервації в рідкому азоті
Варіант | Зростання протокормум, % | Розмір носія, протофіду, мкм | Протокормуми, що брунькуються, % від зростаючих |
ПВС2+ЛН | 9 | 1500 | 100 |
PVS2 | 36 | 1900 рік | 75 |
КОНТРОЛЬ | 100 | 1900 рік | 100 |
Примітка: початковий середній розмір протофідів становить 1200 мкм. ЛН - рідкий азот. PVS2 - (plant vitrification solution 2) склоподібний розчин. Вирощування - 180 днів. на світлі.
Сучасні технології дозволяють створювати кріобанки не лише насіння, а й протокормів і культур клітин меристем і орхідей, але в цьому напрямі ще робляться лише перші кроки [13, 14, 15]. Це завдання стає ще більш актуальним, якщо поставити собі за мету довготривале кріоконсервування найвидатніших сортових клонів, які зберігають свій генотип лише на соматичному рівні. Якщо порівняти кількість природних видів орхідей (19,5 тис. офіційно зареєстрованих видів і імовірно 10 тис. видів у природі, ще не описаних) з кількістю штучно створених гібридів (понад 100 тис. офіційно зареєстрованих таксонів) [16], то потреба у широкомасштабному застосуванні методу кріозбереження протокормових і меристемних культур може зрости в десятки й сотні разів.
Література
