Товарів: 0
На суму: 0 грн
УДК 634.22: 581.143.6
І.Г. Тихонова
Державна наукова установа Всеросійський науково-дослідний інститут генетики і селекції плодових рослин ім. І. В. Мічуріна, Мічурінськ
Представлено біотехнологічні методи отримання здорових і стійких до вірусних захворювань сомаклонів вишні з уражених листкових експлантів.
Індукція сомаклональної мінливості шляхом введення її в культуру in vitro є одним із перспективних напрямків селекційного вдосконалення існуючих сортів [1].
У зв’язку з широким розповсюдженням вірусних хвороб некротичної вишні (НРСВ), хлоротичної (ПДВ) [2, 3], зеленої (ГРМВ) [4] кільчастих плямистостей, а також ямчатості деревини кісточкових плодів (П. стеблової ямчатості) та їх комплексів погіршується врожайність, якість плодів і лежкість уражених дерев, а також їх репродуктивні здібності (схожість насіння та приживлюваність бруньок). в дитячій кімнаті). Через сильне ураження вірусними хворобами багато цінні сорти кісточкових культур вилучаються з виробництва. У зв'язку з цим ряд європейських країн перейшли на безвірусне розсадництво, яке передбачає постійний фітосанітарний контроль із застосуванням імунодіагностики вірусів. Проте одним із найефективніших способів захисту рослин від вірусних хвороб є отримання стійких сортів, що є найважливішою умовою переходу до адаптивної системи рослинництва, тобто екологічної безпеки та рентабельності.
В результаті багаторічної оцінки генофонду вишні на стійкість до поширених вірусних захворювань та гібридизації контрастних за сприйнятливістю до вірусів сортів вишні ми отримали відносно стійкі та стійкі елітні форми вишні [5], стійкість яких можна підсилити зворотним схрещуванням, але це досить довгий шлях, крім того, низька схожість насіння є серйозною перешкодою для збільшення генетичного різноманіття цього. культури.
В даний час інтенсивно розробляються методи отримання здорових і створення стійких форм рослин за допомогою технологій культивування клітин і тканин in vitro.
Одним із завдань біотехнології рослин є розробка нетрадиційних методів селекційного поліпшення рослин на стійкість до вірусних хвороб і отримання більш здорових форм за допомогою сомаклональних варіантів. Серед можливих джерел сомаклонів – генетична гетерогенність клітин рослинних тканин, спонтанний і транспозонний мутагенез, процеси рекомбінації в клітинах [6]. У сомаклональних варіантах виявлені зміни плоїдності, хромосомні перебудови, точкові ядерні та цитоплазматичні мутації.
Сомаклональна мінливість являє собою високий рівень спонтанної мінливості в культурах соматичних клітин, а також в отриманих з них популяціях регенерованих рослин. Сомаклональна мінливість серед регенеруючих рослин є широко поширеним і генетично доведеним явищем. Це результат генетичної гетерогенності тканин вихідного експланта. Селекція тканин базується головним чином на сомаклональних варіаціях, що представляє інтерес як простий спосіб отримання генетичного різноманіття шляхом регенерації клонів рослин із клітинних культур.
У популяціях сомаклонів виявлено варіанти, що перевершують вихідні сорти за різними господарсько-цінними ознаками, в т.ч. на стійкість до вірусних захворювань [7]. Клітинна селекція на стійкість до вірусів складніша порівняно з грибами та бактеріями через відсутність селективних систем. Відомо, що калюсні тканини, індуковані із системно інфікованих рослин, являють собою мозаїку здорових та інфікованих вірусом клітин [8].
Встановлено, що потомство сомаклонів, регенерованих з інфікованої калюсної тканини, має вищу стійкість до вірусів, ніж відповідні сомаклони зі здорових каллюсів. Завдяки тотипотентності рослинної клітини з гетерогенної популяції клітин з різною чутливістю до вірусів можна отримати здорові та вірусостійкі форми [9].
Виявлено переважну проліферацію безвірусних і вірусостійких клітин у культурах калюсу тютюну, інфікованих важким штамом ВТМ [10]. Встановлено, що потомству сомаклонів передається висока стійкість.
Безвірусні рослини регенерували з темно-зелених острівців, заражених вірусом мозаїки листя буряка [11].
Стійкість, індукована ВТМ-інфікованим листям тютюну, з високою ефективністю передається прямим регенерантам і проявляється в першому поколінні їх нащадків. Вважається, що перенесення індукованої резистентності на прямі регенеранти можна використовувати для захисту вегетативно розмножуваних рослин від вірусів [12].
Щоб індукувати калусогенез, експланти листя вишні, інфіковані вірусами NKP і HKP, асептично вводили в культуру in vitro на модифікованому середовищі MS, що містить 2,4-D 1.0; IAA, NAA та кінетин по 0,5 (в мг/л). Пробірки з експлантатами зберігали в термостаті при температурі 20-24 °С.
Відбір тканини для регенерації проводили за інтенсивністю росту калюсу, оскільки між ростом калюсу та репродукцією вірусу в ньому існує обернена залежність [9].
Зональний розподіл вірусів у культурі тканин пробірки, встановлений Л.Г. Брегетова та ін. [8], використовували для отримання здорового калюсного матеріалу, оскільки віруси були присутні у верхній зоні калюсного стовпа, що складається зі старих клітин, але не в нижній зоні, утвореній молодими клітинами. Тканина калюсу звільняється від вірусів під час субкультивування.
Щоб індукувати морфогенез, відібрані заражені калюси вишні розсікали та переносили в середовище для регенерації. Для окремих груп генотипів підбирали співвідношення регуляторів росту в середовищі регенерації. Найкращі результати щодо закладення бруньок і придаткових пагонів із інфікованої тканини калюсу отримано на модифікованому середовищі MS, що містить BAP 5,0-9,0; IQI 1.0; 2,4-Д 1,0; ГК 1,0 (в мг/л).
Субкультивування морфогенних калюсів проводили в люміностаті в умовах 16-годинного фотоперіоду з інтенсивністю освітлення 1500-3000 лк і температурою 20-24 °С.
На формування органогенних структур позитивно впливає додавання до середовища регенерації метилурацилу (10-30 мг/л); спостерігається позеленіння тканини з наступним утворенням бруньок, які пересаджували на середовище морфогенезу без 2,4-Д. Сформовані бруньки переносили на середовище для формування пагонів (БАП, ІУК та ГК по 0,5 мг/л).
Оскільки багато бруньок припиняють розвиток на пагоноутворюючому середовищі, їх знову пересаджували на морфогенезне середовище. У результаті кількох пасажів урожайність пагонобудівних бруньок значно зросла.
Певну кількість ночей і пагонів у важковідновлюваних генотипах можна отримати шляхом прямої регенерації методом in situ, тобто безпосередньо з темно-зелених острівців ураженої вірусом тканини листка на середовищі, що містить BAP 3,0-5,0; ІУК 0,7-1,5; ІМК 0,5; ГК 1,0 (в мг/л) з додаванням метилурацилу (10-30 мг/л) і витримуванням експлантів при низьких плюсових температурах протягом двох тижнів.
Субкультивування бруньок, що утворилися при прямій регенерації, на середовищі морфогенезу з метилурацилом і 2,4-Д при низьких позитивних температурах протягом кількох пасажів призвело до масового утворення меристематичних конусів росту, а потім і бруньок. Таким чином можна ініціювати регенерацію сортів, які важко регенерувати, щоб отримати рослини прямого регенерації з вищим потенціалом стійкості.
Придаткові пагони, отримані із сформованих бруньок, переносили на середовище для розмноження (БАП 1-2 мг/л, ІУК і ГК по 1 мг/л) у пробірки або колби (250 мл). Вирощування пагонів у колбах з додаванням 14-28 мг/л саліцилової кислоти призводило до збільшення довжини пагонів і коренеутворення навіть без застосування ІМК.
Сомаклони, які сформували розгалужену кореневу систему, адаптували до нестерильних умов середовища та висадили у відкритий ґрунт для дорощування. З 12 відновлених сортів вишні сомаклони форм гріну вирощуються у відкритому ґрунті, після чого їх перевірять на наявність вірусів. Методом штучного зараження буде визначено ступінь стійкості сомаклонів до окремих вірусів.
Література
