Сучасні досягнення біотехнології - Культивування in vitro та регенерація із соматичних тканин сливи домашньої

УДК: 634.22 : 581.143.6
ВИРОЩУВАННЯ IN VITRO ТА РЕГЕНЕРАЦІЯ З СОМАТИЧНОЇ ТКАНИНИ ДОМАШНЬОЇ СЛИВИ
С.А.Муратова
Державна наукова установа Всеросійський науково-дослідний інститут генетики і селекції плодових рослин ім. І.В. Мічуріна, Мічурінськ
Для ряду виведених перспективних сортів сливи вітчизняної визначено умови культивування in vitro та адаптації до відкритого ґрунту. Виявлено особливості поведінки досліджуваних сортів в умовах стерильного культивування. Вивчено можливості морфогенезу дев’яти сортів сливи. Досягнуто регенерацію цілих рослин із ізольованих соматичних тканин сортів сливи вітчизняної селекції з частотою до 80-85%. Визначено значущість впливу на ефективність регенерації окремих факторів, таких як генотип рослини, мінеральний і гормональний склад середовища, джерело і концентрація вуглецю, тип експлантату та його розташування на живильному середовищі.
Протокол для відтворюваної системи регенерації сливи з ізольованих соматичних тканин необхідний для досліджень у різних областях біотехнології, включаючи соматичну гібридизацію, селекцію клітин і генну інженерію. Прогрес, досягнутий у цьому напрямку, сприятиме використанню методів біотехнології в селекції сливи, що в кінцевому результаті призведе до створення сортів з якісно новими ознаками, які важко або неможливо отримати класичними методами селекції.
Роботи різних дослідників з органогенезу тканин кісточкових плодів кульмуру показали, що успіх залежить насамперед від морфогенетичних можливостей генотипу, типу експланта, складу живильного середовища і, насамперед, від типу, співвідношення та концентрації використовуваних регуляторів росту рослин. S. Mante, R. Scorza та J.M. Cordts [1] досягли високої частоти регенерації пагонів із незрілих сім’ядолей Primus persica та зрілих сім’ядолей Primus domestica та Prunus cerasus, вперше використавши синтетичний регулятор росту як речовину з цитокініновою активністю при регенерації Prunus. N-феніл-N'-1,2,3-тидіазоліл-5-сечовина (тідіазурон), ефективність якого на той час була показана на ряді рослинних об'єктів. Встановлене співвідношення регуляторів росту в живильному середовищі було досить успішно застосовано в наступних дослідженнях при регенерації з гіпокотилів сливи [2,3], при регенерації з листкових експлантів Prunus domestica [4, 5], двох клонів абрикоса і кількох клонів сливи [6], Prunus serotina і P.avium [7], абрикоса сорту Helena» [8]. індукція морфогенезу від соматичних тканин Prunus досліджено вплив мінерального складу середовища [6], джерела вуглеводів [9] та орієнтації експлантів на живильному середовищі [8] на ефективність регенерації.
Більшість робіт з регенерації Prunus проводили на насіннєвому матеріалі або з використанням соматичних тканин підщепних форм і міжвидових гібридів, які мають вищий морфогенетичний потенціал порівняно зі сортами. Водночас є лише поодинокі повідомлення про успішне відновлення сортових рослин сливи вітчизняної. Ф. Коссіо, Г. Бассі [10] досягли відновлення сорту Блюфре. Регенерати отримували з листкових живців бельгійського сорту Альтессе проста, болгарських сортів Кюстендильська слива та Стенлі [4, 5].
Метою даного дослідження була розробка ефективних методів культивування in vitro та регенерації із соматичних тканин культивованих сортів сливи (Primus domestica) в умовах середньої смуги Росії.
Досліди включали сорти сливи (Prunus domestica). Ренклод Харитонова, Італійська Угорська, Ода, Синьоока, Радість, Євразія 21, Рання Зарічна, Етюд, Початок.
Для культивування сливи in vitro використовували мінеральну основу середовищ Murashige-Skoog [II] і Quorin-Leporier [12], доповнену мезоінозитом – 100 мг/л, гідролізатом казеїну – 100 мг/л, сахарозою – 30 г/л, агаром – 6-7 г/л. На етапах інтродукції та мікророзмноження сливи використовували 6-БАП - 1-3 мг/л, ГК - 0,5-2,0 мг/л, НАК - 0,1-0,3 мг/л або ІМК - 0,1-0,3 мг/л та комплекс вітамінів. На етапі вкорінення мікрочерешок концентрація макросолей і сахарози зменшувалася вдвічі. ІМК використовували як індуктор ризогенезу. У середовище вносили ауксин (0,2-2,0 мг/л) або мікрочерешки замочували в розчині ІМК (50 мг/л протягом 18 годин), а потім висаджували на середовище без регуляторів росту. рН живильного середовища встановлювали в межах 5,6-5,8. Рослини культивували при t=26±2 °C і 16-годинному світловому дні.
Листя пагонів сливи, культивованих in vitro, використовували як джерело рослинної сировини в експериментах з індукції морфогенезу із соматичних тканин. Кожен листок розрізали поперек центральної жилки на 2-3 експлантати площею 0,5-1,0 см2. Вирощували живці листкових пластинок у формі рівнобедреного трикутника з черешками та середніми частинами листкових пластинок. У ряді експериментів з регенерації експлантатами слугували також черешки листків (0,3-0,5 см) і відрізки стебла (0,4-0,7 см) або коріння (0,7-1,5 см) стерильних рослин.
Експланти культивували в живильному середовищі MS. У дослідах з вивчення впливу джерела вуглецевого живлення на ефективність регенерації використовували сахарозу, лактозу, глюкозу, фруктозу, мальтозу в концентрації 10-40 г/л. Як основні регулятори росту використовували речовини з цитокініновою активністю: 6-БАП, тидіазурон (ТДЗ), зеатин, 2іп у концентрації 1,65-5 мг/л та ауксини: НАК, ІБА, 2,4-Д, ІУК у концентрації 0,1-0,5 мг/л у різних комбінаціях. Регулятори росту та вітаміни фірми Serva, Німеччина.
Відновлені пагони зрізали з листкових пластинок і вирощували за стандартною схемою клонового мікророзмноження сливи.
У результаті досліджень встановлено, що найбільш сприятливим періодом для введення сливи в культуру in vitro є фаза виходу рослин зі стану спокою (лютий-березень). Стерилізація живців довжиною 0,7-1,3 см з нерозрослими бруньками 0,3% розчином ртутної селітри протягом 30 хвилин не забезпечила достатньої ефективності внесення: 76-92% рослинного матеріалу було заражено грибами і бактеріями. У разі використання меристематичних верхівок розміром 0,2-0,4 см, ізольованих від бруньок, що розвиваються, відсутність покривної тканини та невеликі розміри експлантату забезпечували досить ефективну стерилізацію: інфіковано лише 9-16% рослинного матеріалу кожного сорту. Однак нітрат ртуті також був токсичним для тканин рослин, викликаючи загибель 1/3-1/2 експлантів.
Клонове мікророзмноження сливи проводили за традиційною моделлю проліферації пазушних пагонів. Внесення 6-БАП у живильне середовище призводило до усунення верхівкового переважання та стимулювало утворення пагонів із пазушних бруньок. Застосування модифікованого живильного середовища Кворін-Лепор’є із співвідношенням регуляторів росту 1-2 мг/л 6-БАГТ, 0,5-1 мг/л ГК, 0,2 мг/л НАК у нульовому (введення в культуру) та першому пасажах дозволило отримати життєздатні конгломерати з 3-6 бруньок і пагонів усіх сортів до кінця першого пасажу.
Швидкість розмноження сливи залежала від особливостей сорту та концентрації цитокініну в живильному середовищі. Найбільш ефективна концентрація 6-БАП у живильному середовищі становить 1-2 мг/л у фазі розростання бруньок і пагонів у поєднанні з ГК – 1-2 мг/л, НАК або ІМК – 0,2 мг/л. За цих концентрацій гормону досліджувані сорти мали середні коефіцієнти відтворення за пасаж у межах 3,6-6,5. Наявність ГК у середовищі забезпечувала формування достатньої кількості пагонів довжиною понад 1,5 см, придатних для вкорінення, що виключало проміжний етап культивування в середовищах зі зниженою концентрацією цитокініну (0,01-0,25 мг/л), рекомендованим рядом авторів у пасажі перед укоріненням [13, 14].
Застосування цитокініну в концентрації 3 мг/л підвищувало швидкість розмноження. Але в цьому випадку, як правило, утворювалися пагони з укороченими міжвузлями і пророслими бічними бруньками довжиною не більше 1,5 см. Ці пагони додатково вирощували.
Наші дослідження показали, що ефективність укорінення сливи значною мірою визначається генотипом. Дані щодо укорінення пагонів різних сортів сливи на розведеному середовищі Кворін-Лепор’є за концентрації ІМК у середовищі 1 мг/л наведено в таблиці. Застосування розведеного середовища Мурасіге-Скуга не призвело до істотної зміни частоти ризогенезу у досліджуваних сортів. У результаті досліджень виявлено легковкорінювані сорти сливи сорго Євразія 21, Етюд, Ода, які утворювали більшу кількість коренів на одну укорінену рослину. Для цих сортів концентрація ІМК у середовищі для укорінення була знижена до 0,5 мг/л.
Таблиця
Ефективність укорінення різних сортів сливи
на 1/2 QL середовища при концентрації IBA 1 мг/л

Спосіб внесення ІМК практично не вплинув на частоту вкорінення легковкорінюваних сортів сливи, але знизив ефективність укорінення важковкорінюваних генотипів. Так, при замочуванні мікроживок у розчині ІМК (50 мг/л протягом 18 годин) ефективність укорінення сортів Євразія 21 та Етюд становила 97-100%, як і при внесенні в середовище ауксину в концентрації 0,5-1,0 мг/л. Тоді як через 6 тижнів культивування лише 19,0% мікрочеренків сорту Сінеокая прижилося при замочуванні в розчині ауксину і 53,2% мікрочеренків при внесенні в середовище ІМК.
Широкий спектр фізіологічної активності регуляторів росту та досягнуті з їх допомогою успіхи в реалізації морфогенетичного потенціалу рослинної клітини дозволяють вважати регулятори росту одним із основних факторів контролю морфогенезу in vitro. В останні десятиліття найбільш успішно для регенерації з ембріональних і соматичних тканин Prunus використовується тидіазурон [1-8].
У наших дослідженнях застосування ТДЗ та ІМК у концентраціях, які найчастіше використовуються під час регенерації сливи (1,65-2,8 мг/л ТДЗ + 0,1-0,5 ІМК), не дало бажаного ефекту. Частота відновлення пагонів із тканин листка досліджуваних сортів сливи не перевищувала 2-12 %. Позитивний ефект досягався при підвищенні концентрації ТДЗ до 4-5 мг/л. Оцінено ефективність застосування цитокініну з ряду дифенілсечовини в порівнянні з похідними аденіну.
Для ряду різновидів перевага використання ТДЗ порівняно з 6-БАП не доведена. Загальною закономірністю, характерною для всіх сортів, є збільшення частоти регенерації коренів на середовищах з ТДЗ порівняно зі середовищами, що містять 6-БАП як цитокінін. Спостерігали суттєві сортові відмінності у реакції на гормональні фактори зовнішнього середовища (рис. 1).

Рис. 1. Відновлення придаткових пагонів листкових експлантів чотирьох сортів сливи вітчизняної.

Для сортів Стартова та Євразія 21 ефективним виявилося поєднання ТДЗ та НАА, а використання ТДЗ у поєднанні з ІМК у тих самих концентраціях не було ефективним. Сорт Етюд найкраще відновлювався на середовищах з вмістом 4-5 мг/л БАП і 0,2 або 0,5 мг/л ІМК. Для цього сорту позитивний ефект досягався при додаванні в середовище 0,5 мг/л ГК (46,1% відновлення пагонів). Сорти Радість і Синеокая відновлюються без істотних відмінностей як на середовищах з ТДЗ, так і на середовищах з 6-БАП. Частота відновлення пагонів досягала 30%. None of the tested combinations of hormones is effective enough to induce adventitious shoots of the Oda variety.
Як показали результати наших досліджень, відновлення пагонів відбувається лише за кількісного переважання цитокініну над ауксином у співвідношенні від 8:1 до 25:1. Найбільшу частоту відродження пагонів було отримано на середовищах, що містили БАП або ТДЗ як субстанцію з цитокініновою активністю в концентрації 5 мг/л. Найменш ефективним виявилося застосування 2іп при обробітку листових тканин сливи. Ще більше частота регенерації залежала від типу введеного в середовище ауксину.
Аналіз літературних даних показує, що під час регенерації кісточкових плодів майже завжди використовували IBA або NAA. За нашими даними, найвдалішими раніше перевіреними комбінаціями по відновленню сливи є БАП+ІМК, БАП+НУК, ТДЗ+НУК (до 50-60% відновлення пагонів сорту Етюд і сорту Стартова). Проте заміна цих ауксинів на 2,4-Д або ІУК дозволила суттєво підвищити частоту регенерації ряду сортів сливи (до 70-85% регенерації пагонів). Крім того, на середовищах з цими ауксинами не спостерігалася регенерація кореня, яка часто мала місце на середовищах з ІМК або НАА.
Досліджено вплив ряду інших факторів на індукцію морфогенезу, зокрема джерела вуглецевого живлення в середовищі. Оцінено вплив на процес регенерації п'яти вуглеводів - сахарози, глюкози, мальтози, фруктози і лактози. Найбільш активно стимулюється
утворення і ріст калюсу і, що більш важливо, диференціація додаткових бруньок і пагонів, глюкоза і сахароза.
У наших дослідженнях найбільш інтенсивне утворення меристематичних вогнищ відбувалося при концентрації вуглеводів у середовищі 30 і 40 г/л. Так, на середовищах із вмістом вуглеводів у кількості 30 і 40 г/л відповідно на глюкозі (середовище МС: БАП 5+ГК 0,5+ІМК 0,2 мг/л) отримано 36,2 % і 39,2 % відродження пагонів сорту Етюд, на сахарозі — 15,7 % і 25,5 %. Проте на середовищах, що містять сахарозу, регенеранти відзначалися кращим розвитком і відсутністю пагонів з морфологічними змінами. Для оптимального розвитку пагонів морфогенні утворення, отримані на середовищах з глюкозою, пересаджували на середовища з сахарозою.
Оцінено морфогенетичний потенціал різних частин вегетативних органів рослини – листя, стебла, кореня. При використанні черешків і сегментів стебла регенерація проходила через стадію формування калюсу з утворенням меристематичних вогнищ у первинному калусі та їх подальшим розвитком у бруньки та пагони. Але мозоль утворювалася не у всіх випадках; формування калюсу було особливо слабким на сегментах стебла. При обробітку кореневих відрізків досить інтенсивно відбувалося калюсоутворення, але бутоноутворення не спостерігалося.
За нашими даними, тканини листка сливи мають вищий морфогенетичний потенціал порівняно з тканинами стебла та кореня. Морфогенетичний потенціал також неоднаковий по довжині листка, а саме зростає до основи листка, тобто до його частини, що росте. За даними ряду авторів, на P.canescens [15], а також на сіянцях абрикоса і сливи [6] регенерація відбувається переважно на черешках листків і в ділянці головної жилки дистальної частини листка. Наші дані дослідження різних сортів сливи домашньої підтверджують ці спостереження. При цьому, якщо використовувати листові тканини однієї фізіологічної стиглості, то не так істотно, зрізані вони з укорінених або невкорінених пагонів. Цей фактор є другорядним по відношенню до таких визначальним факторам, як генотип рослини, склад середовища, вік експланта.
Значний вплив на калюсоутворення та органогенез у культурі експлантованих листків сливи мала орієнтація експлантів на середовищі. За нашими даними, експланти слід розміщувати на середовищі адаксіальною (верхньою) стороною, оскільки при абаксіальній орієнтації процес утворення калюсу сильно гальмується, а тканини листка швидко некротуються.
Як показали результати наших досліджень, модель і ефективність регенерації із соматичних тканин сливи визначається низкою факторів, основними з яких є генотип рослини, гормональний і вуглеводний склад живильного середовища, тип експланту.
Заключним етапом культивування in vitro є адаптація отриманих рослин до природних умов зростання. Адаптацію укорінених рослин in vitro можна проводити як у спеціально обладнаних теплицях з регульованою температурою і вологістю повітря цілий рік, так і шляхом висаджування їх у весняно-літній період безпосередньо в нестерильний ґрунт під плівкові укриття за наявності повітряно-крапельного зрошення. Залежно від сорту адаптованими до нестерильних умов є від 51,7 до 95,7 % рослин сливи, отриманих in vitro.

Література

Ще почитати:

Міжнародні відносини о найменуванні шампанського та хереса

В чому різниця між шампанським, просеко та ігристим вином?

Отримання червоних ігристих вин пляшковим способом з винограду перспективних сортів

Ігристі вина

Токайські вина

У нашому блозі «Приватна Марка» багато цікавого контенту: новинки ринку виноробства, крафтові рецепти наших технологів, влоги на різні теми. Дистиляція, крафтові винокурні, виробництво крафтового сидру, крафтовий квас, рецептура сидру, виробництво крафтових напоїв за нашими рецептами, виробництво спирту в промислових масштабах. Це та багато іншого цікавого у блозі «Приватна Марка Україна» та мережі магазинів «Винороб».

Наприклад, ви вирішили відкрити сироварню, ковбасний цех або почати пекти крафтовий хліб — welcome! Ми завжди допоможемо: надамо рецептуру, забезпечимо всі витратні матеріали, відправимо нашого технолога, складемо технологічну карту, встановимо все обладнання, сертифікуємо виробництво, відкриємо для вас завод з нуля, виноробні, цехи, виноградники, налагодимо готовий продукт із виходом на ринок. Ми — компанія повного циклу: маємо багато представництв по всьому світу. Потрібна склотара, склобанки, медичний посуд, лабораторний посуд чи лабораторне обладнання — звертайтеся! У наших складах понад 900 тис. найменувань товарів та обладнання. Звертайтеся, не вагайтеся! Не важливо, де ви знаходитесь — у СНД, Європі, Америці чи Азії: ми маємо великий досвід. Privatna Marka йде в ногу з технологіями та інноваціями. Ми 20 років на ринку та відправили понад 1 млн посилок своїм клієнтам. Втілили багато креативних проєктів. Відкрили низку підприємств харчової промисловості, а також у непродовольчій та продовольчій групах технічних виробів. Втілили 147 комерційних проєктів у країнах СНД. Виробляємо 70 видів продукції власного виробництва в Україні, Німеччині та Китаї. У блозі ще більше цікавого та корисного.

Консультації за тел. +380 (67) 440-70-90
https://privatnamarka.com/
https://www.instagram.com/privatnamarka?igsh=MWt0NzNxbHJrbXh4ZQ==\
https://www.facebook.com/Privatnamarka
https://youtube.com/@privatnamarkacom?si=P5RH_spetEP3x_RQ\