Товарів: 0
На суму: 0 грн
УДК 634.11: 631.522: 581.143.6
КУЛЬТУВАННЯ ПИЛЬНИКІВ ЯБЛУНІ IN VITRO: ДОСЯГНЕННЯ ТА ПЕРСПЕКТИВИ
Н.І. Савельєв, О.Я. Олейникова
Державна наукова установа Всеросійський науково-дослідний інститут генетики і селекції плодових рослин ім. І.В. Мічуріна, Мічурінськ
Наведено результати вивчення in vitro андрогенезу яблуні. Розроблено спосіб масового виробництва андрогенних калюсних тканин із різних генотипів яблук. У чотирьох з них наразі досягнуто відновлення рослин. Детально наведено умови їх виготовлення – склад поживних середовищ, основні параметри фізичних факторів. Встановлено, що поряд з індивідуальними особливостями індукції андрогенних рослин яблуні існують умови для успішного здійснення цього процесу, загальні для всіх генотипів.
Плодові культури, найважливішою з яких є яблуня, є дуже складним матеріалом для селекційно-генетичних досліджень, оскільки мають складну гетерозиготну природу, багаторічний цикл розвитку і не можуть розмножуватися з насіння. Використання при роботі з ними лише традиційних, класичних методів, заснованих на гібридизації та селекції, не дозволяє повною мірою вирішити проблеми прискорення селекційного процесу та підвищення ефективності генетичних досліджень. Важливу роль у їх реалізації може відіграти поєднання класичних і сучасних біотехнологічних методів і прийомів, таких як андрогенез in vitro – культивування ізольованих пиляків і мікроспор на штучних поживних середовищах. Цей метод заснований на здатності клітин мікроспор і пилкових зерен за певних умов переходити у своєму розвитку з характерного для них гаметофітного шляху на принципово інший - спорофітний - шлях розвитку з утворенням гаплоїдних рослин.
В даний час андрогенез in vitro є найшвидшим і ефективним способом отримання гаплоїдних, а на їх основі гомозиготних рослин і ліній. Розроблено і широко використовується в селекції однорічних і дворічних культур. Проте для багаторічних плодових рослин, зокрема яблунь, метод масового виробництва гаплоїдних і гомозиготних рослин на основі андрогенезу in vitro ще не розроблений. Лише в деяких його генотипах з низькою частотою отримано андрогенні новоутворення - каллуси, ембріоїди різного рівня плоїдності та пагони-регенеранти, серед яких виявлено гомозиготні, стійкі до парші подвійні гаплоїди [1,2]. Недостатність досліджень in vitro андрогенезу яблуні та обмеженість отриманих результатів пов’язані з тим, що у плодових рослин андрогенетичні процеси (калюс, ембріон, морфогенез) індукуються з великими труднощами та характеризуються низькою ефективністю, нестабільністю та важкою відтворюваністю. Крім того, умови отримання андрогенних рослин-регенерантів, пов'язані, головним чином, з підбором селективних компонентів для штучних поживних середовищ, необхідно підбирати окремо для кожного генотипу.
Протягом ряду років ми вивчали андрогенез in vitro в різних генотипах яблук. У результаті досліджень встановлено, що розвиток пиляків яблуні in vitro відбувається по шляху утворення калюсної тканини (непрямий андрогенез); утворення ембріоїдів (прямий андрогенез) не відзначено. Розроблено методику масового отримання гетерогенних (з клітинами різного рівня плоїдності – від гаплоїдних до поліплоїдних) калюсних тканин із пиляків, що дає змогу отримувати такі калюси практично з усіх генотипів яблуні з різною частотою.
У двох сортів – Важак і Ліберті – індуковано сходи регенерації [3, 4]. Загалом ці дослідження показали, що in vitro андрогенез у яблуні є дуже складним, багатоетапним процесом, який складається з низки послідовних етапів – утворення калюсу, регенерації, розмноження та укорінення. Для успішної реалізації кожного з них необхідні свої специфічні умови, насамперед певний склад поживних середовищ і оптимальні параметри фізичних факторів, основними з яких є світло і температура.
При вивченні in vitro андрогенезу у форм яблуні з комплексом селекційно-господарсько цінних ознак: стійкість до парші (ген Vj), колоновидність крони (Со), зимостійкість встановлено, що середня частота утворення калюсу в них становить 32 %, а попередньо рекомендована холодна обробка пиляків протягом 24-72 годин [3] може бути довшою – до 8-10 днів. Не впливаючи на загальний урожай андрогенних каллусів, він значно (в 1,5-2 рази) збільшує серед них кількість морфогенних, які згодом здатні утворювати такі органи, як нирки, а в окремих випадках і пагони регенерації.
За активністю андрогенного калюсоутворення всі досліджені генотипи умовно розділили на три групи. Перший — з високою активністю цього процесу (частота калюсоутворення більше 30%), до нього увійшли такі сорти, як Успенське, Витязь, Билина, Бессемянка, а також колонка 11-7 і гібрид 25-8. Друга група – із середньою калюсоутворювальною активністю (від 10 до 30%), до неї входять сорти – Скала, НХОС, Зірочка, Антонівка звичайна, колонки 3-19 і 11-62. Третій – з найменшою частотою калюсоутворення (менше 10%) виявився найменшим, до нього увійшли три генотипи – гібриди 32-37, 12-59 та сорт Ренет Черненко. Більше половини отриманих каллюсів мали щільну консистенцію, горбисту поверхню з білим опушенням, на світлі вони швидко зеленіли. Такі калюси вважаються морфогенними. Велика їх кількість (до 80%) відзначена у сортів Успенське, НХОС, Скала, Витязь, колонка 11-7. Були й неморфогенні калюси – пухкі, водянисті, безбарвні або сірі. Від 30 до 50% таких каллюсів становили сорти Зірочка, Антонівка звичайна, Пепін шафранний і гібрид 32-37.
Для індукування морфогенних утворень в отриманих андрогенних каллюсах яблука їх пасували на спеціальних, так званих регенераційних, середовищах з підвищеним порівняно з ауксинами вмістом цитокінінів. В якості ауксину використовувався переважно NAA (нафтилоцтова кислота) у концентрації не більше 1 мг/л. Цитокінінами в наших дослідах були 6-бензиламінопурин (БАП) і кінетин в діапазоні концентрацій від 2 до 10 мг/л.
У результаті досліджень вперше досягнуто відновлення пагонів в андрогенних каллюсах яблуні NHOS (з частотою близько 30% від кількості отриманих калусів) та Витязь (20%). Регенеранти отримували наступним чином. Пильовики обох форм яблуні попередньо обробляли при низьких температурах (+3...+5°С) протягом 8 діб перед посівом на поживні середовища. Середовище Мурасіге-Скуга слугувало основою на всіх етапах одержання регенерантів. Вихідним середовищем, на якому утворювалися морфогенні калюси, які згодом відроджували пагони, у яблуні NHOS було середовище, яке включало кінетин, ІУК, ІБА, НАК, 2,4-Д у кількості 1 мг/л, а у сорту Вігяз містило (у мг/л): кінетин – 2,0; МВК - 3,0; 2,4-Д - 0,8; BAP -1,0.
Усі пильовики після посіву і до утворення калюсів культивували в темряві за температури 24±2 °С і відносної вологості повітря 60-70 %; ці параметри температури і вологості підтримувалися на всіх наступних етапах. Після формування калюсів їх витримували на 16-годинному фотоперіоді з освітленістю 1000-1500 лк (такі умови освітлення спостерігалися надалі). Через 7-10 днів отримані калюси поміщали на регенераційні середовища. Всього обидві форми яблуні мали три таких пересадки (пасіювання) з інтервалами між ними 1,5-2 місяці. В усіх випадках відроджені пагони отримували на третьому пасажі. Склад поживних середовищ і послідовність їх заміни були такими. Для яблунь NHOS: 1-й пасаж - 1 мг/л НАК, 2 мг/л БАП (середній Р); I - те саме середовище, Р; III - 1 мг/л НАК, 7 мг/л БАП, 2 мг/л кінетин (Pj) - через 2 місяці калюси на цьому середовищі утворили відроджені пагони. У яблуні сорту Витязь відновлення досягнуто таким чином: 1-й пасаж - середній Р; II - Пі; ІІІ - 1 мг/л НАК, 2 мг/л БАП, 5 мг/л кінетин (Р2) - через 1,5 місяці на цьому середовищі відзначали появу сходів у каллюсів.
Усі отримані пагони андрогенного регенеранта успішно розмножувалися на середовищі з 1 мг/л ІУК, 2 мг/л БАП, 1 мг/л ГК (коефіцієнт розмноження більше 10). Укорінення пагонів досягали на середовищі з 2 мг/л ІМК з використанням тритижневої темряви.
Цитологічне дослідження деяких отриманих регенерантів показало, що більше половини з них є диплоїдами, але не можна виключити можливість наявності серед них подвоєних гаплоїдів; це буде з'ясовано в процесі подальших досліджень; Зустрічаються також рослини з клітинами різного рівня плоїдності - від гаплоїдних до поліплоїдних.
Аналіз результатів як даних, так і раніше проведених [3, 4] досліджень андрогенезу in vitro у яблуні показав, що для досліджуваних нами генотипів яблуні поряд з індивідуальними існують і загальні умови отримання рослин-регенерантів. Таким чином, параметри фізичних факторів (температура, освітленість та ін.) для культивування пиляків, каллюсів і рослин-регенерантів однакові для всіх генотипів. На етапі індукції пагоноутворення майже у всіх генотипів, які утворювали регенеранти, використовували середовища зі співвідношенням ауксин:цитокінін 1:2 (Р) та 1:9 (Рі). Більшість використовуваних регенераційних середовищ містили два цитокініни - BAP і кінетин; концентрація кожного з них, а також послідовність зміни середовищ були індивідуальними для кожного конкретного генотипу.
Загалом проведені дослідження є певним кроком до створення технології масового виробництва гаплоїдних і гомозиготних рослин у плодових культурах на основі андрогенезу in vitro. Для успішного вирішення цієї проблеми подальші дослідження будуть спрямовані на вивчення механізмів морфогенетичних процесів в андрогенних калусах та індукції прямого андрогенезу. Гетерогенність андрогенних каллюсів може певною мірою обмежувати врожайність гаплоїдних рослин, водночас слугуватиме в майбутньому джерелом для отримання нових генотипів різного рівня плоїдності, які не існують у природі, але є цінними для генетики та селекції.
Література
