Товарів: 0
На суму: 0 грн
Розділ 12. УМОВИ РОЗВИТКУ ТА ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ МОЛОЧНОКИСНИХ БАКТЕРІЙ У ВИНІ
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ РОСТУ БАКТЕРІЙПопуляція бактерій визначається двома параметрами: мікробною щільністю, тобто масою клітин в одиниці об’єму, і клітинною концентрацією, тобто кількістю клітин в одиниці об’єму. Збільшення цих двох параметрів відображає ріст бактерій. Маса клітин виражає масу синтезованої органічної речовини, концентрація - число клітинних поділів. У гл. 7 на прикладі дріжджів показано, що для росту мікроорганізмів необхідне поєднання певної кількості факторів і умов.
Поняття «лімітуючий фактор» було визначено в гл. 7, як і будь-який фактор, відсутність або нестача якого тягне за собою зупинку росту. Також визначаються різні фази росту: латентний стан, прискорений розвиток, експоненціальна або логарифмічна фаза, уповільнення, стабільна фаза і смерть (див. рис. 7.1).
Для вивчення розмноження і життєдіяльності молочнокислих бактерій можна використовувати методи, подібні до тих, що використовуються для дріжджів. Метод прямого підрахунку клітин за допомогою гематометра Malasaise також можна застосувати до бактерій із 600-кратним збільшенням; підрахунок стрептококів або стрептобактерій залишається приблизним, оскільки підрахувати елементи ланцюжків неможливо; залежно від їх довжини результати можуть сильно відрізнятися. Крім того, можна визначити кількість бактерій по відношенню до дріжджів, які легше підрахувати, наприклад, в молодому вині.
Лічильна камера клітини Салумбіні розділена на 400 маленьких квадратних чашок глибиною 0,04 мм і площею 0,0025 мм2, тобто кожен з об'ємом 1/10 000 мм3. Суспензію бактерій фіксують у формальдегіді і фарбують метиленовим синім; після 5-хвилинного відпочинку суспензію досліджують під мікроскопом. Сфокусувати та знайти бактерії важко. Поряд з іншими дослідженнями автори відмовилися від методу прямого підрахунку і віддали перевагу методу, заснованому на нефелометричних вимірюваннях з еталонною масою.
Відома залежність між каламутністю бактеріальних суспензій і сухою масою бактерій; однак форма, залежно від того, коки це чи бацили, і розмір клітин можуть спотворювати справжню картину. При дуже обережній роботі в однакових умовах середовища, забарвлення і т. д. каламутність, виміряна нефелометром, може бути виражена в сухій масі бактерій у суспензії, відповідно до заздалегідь побудованого графіка (Меламед, 1962). Для зручності використання одну й ту саму криву можна використовувати для всіх бактерій, хоча існують відмінності (у середньому близько 10%) між бактеріями різної форми. На рис. 12.1 показана крива середнього типу. У таблиці 12.1 показано залежність між масою бактерій і кількістю клітин для двох молочнокислих паличок; в таблиці 12.2 показано вплив форми і розміру бактерій на визначення методом нефелометрії.
Рис. 12.1. Калібрувальна крива залежності між сухою масою бактерій молочнокислого бродіння в суспензії та оптичною густиною, визначеною прямим відліком за шкалою нефелометра.
Чисельність живих бактерій визначають шляхом підрахунку на чашках Петрі. Цей спосіб більш складний у реалізації і менш точний, ніж при роботі з дріжджами. Він дозволяє приблизно розрахувати «життєздатність» сільськогосподарських культур, але не може бути мірилом їх фактичного зростання. Не всі живі клітини розмножуються, і деякі колонії можуть виникати з груп клітин. Цей метод, який дозволив, наприклад, контролювати поведінку молочнокислих бактерій, введених у вино, дає лише порівняльні результати. При наявності живих бактерій у великому обсязі рідини (наприклад, в освітлених винах) краще використовувати фільтруючі мембрани; необхідно, щоб склад живильного середовища, на якому розміщена мембрана, підходив для розвитку у вині молочнокислих бактерій; робота проводиться в атмосфері вуглекислого газу (Paynaud і Sapis-Domerc, 1972).
За розвитком культури також можна спостерігати, періодично визначаючи один із поглинених або утворених елементів. При молочнокислому бродінні цукрів визначають молочну кислоту або, простіше кажучи, підвищення загальної кислотності. Під час яблучно-молочного бродіння вина зникнення яблучної кислоти можна контролювати за допомогою хроматографії або кількісного мікробіологічного або ферментативного аналізу; Нарешті, кількість вуглекислого газу можна визначити манометричним методом або за допомогою спеціального електрода (Лонво, 1975).
Зв'язок між каламутністю бактеріальної суспензії та формою і розміром клітин
Вилки бактерій | Орієнтовні розміри, мкм | Маса бактерій (в мг/л), що спричиняють те саме значення каламутності (75 поділок нефелометра) |
Середні коки | 0,8 | 3.62 |
Великі коки | 1.2 | 3.17 |
Дрібні стрептококи | 0,6 | 3.35 |
бацили |
|
|
короткий | 0,5-1,0 | 3.75 |
довгий, тонкий | 0,5-5 | 3.25 |
довгий, товстий | 0,6-3 | 3.25 |
Таблиця 12.1
Зв'язок між масою молочнокислих бактерій Lactobacillus hilgardii і кількістю клітин
Штами бактерій | Кількість клітин на 1 см* | Вага у вологому стані,* мг/л | Кількість клітин на 1 мг сирої маси | Суха маса, мг/л | Кількість клітин на 1 мг сухої маси |
Штам BC 2 Штам BZ 14 | 3.1-108 | 5970 | 5.2-107 | 335 | 9,5-108 |
*Вага залишку центрифугування після зневоднення.
Таблиця 12.2
Рис. 12.2. Еволюція росту бактерій визначається:
а — за сухою масою бактерій, що утворюються при молочнокислому бродінні цукрів; б — підвищенням кислотності при молочнокислому бродінні цукрів: 1 — Рediococcus cerevisiae; 2 — Leuconostoc oinos A+; 3 - Lactobacillus casei; 4 - Lactobacillus hilgardii.
При вивченні молочнокислого бродіння повного цукровмісного живильного середовища (розбавленого виноградного сусла, збагаченого 5 г/л дріжджового екстракту і доведеного до рН 4,4), інокульованого виділеними з вина бактеріями в кількості 30 000-50 000 на 1 см3 при температурі 25 °С (рис. 12.2), можна зробити наступні спостереження. зробив:
а) вимірювана каламутність з'являється через 24-48 годин після інокуляції; за інших рівних умов латентна фаза у коків довша; Гетеро- або гомоферментативна природа бактерій не впливає на цей фактор;
б) максимальних розмірів популяція досягає у молочнокислих паличок через 4 дні, у коків через 8-12 днів;
Рис. 12.3.Схема еволюції розвитку бактерій і яблучно-молочного бродіння при виробництві червоного вина.
в) вихід бактерій вищий у гетероферментативних видів; значення маси утворених гетероферментативних паличок в 2 рази більше, ніж у гомоферментативних паличок;
г) утворення кислотності починається не відразу; рідина непрозора, а концентрація кислотності, достатня для кількісного визначення, ще не утворилася;
д) утворення кислотності відбувається інтенсивно після заселення. досягне стаціонарної фази; кислотність може подвоїтися з моменту, коли спостерігається максимальний ріст бактерій. Через 20 днів підкислення ще триває. Немає жодного паралелізму, який існує, наприклад, між спиртовим бродінням і розмноженням дріжджів. Бактерії ростуть швидше, ніж дріжджі, але існує невідповідність, розрив між виробництвом молочної кислоти та ростом;
е) максимальні значення результуючої кислотності у різних бактерій мало відрізняються один від одного; у будь-якому випадку вони менш мінливі, ніж максимальні значення маси бактерій.
При аналізі процесу спонтанного росту бактерій з моменту початку переробки винограду за допомогою наведених вище кількісних методів зазвичай виділяють два послідовні цикли росту, які схематично показано на рис. 12.3. Перший починається в перші години бродіння на меззі і протікає паралельно з розвитком дріжджів; розмноження бактерій припиняється з утворенням спирту, і популяція бактерій зазнає дуже сильного зменшення. Кількість живих клітин, що залишилися в молодому вині після спиртового бродіння, може сильно коливатися. Vech (1973) повідомляє, що для швейцарських вин це число коливається від 100 до 80 000 на 1 см3; 2/3 вин мають понад 10 000 живих бактерій на 1 см3. Прихований період, який слідує, більш-менш тривалий. У деяких рідкісних випадках спиртове і яблучно-молочне бродіння можуть збігатися за часом, що небажано; найчастіше прихований період триває кілька днів або кілька тижнів, якщо є будь-який лімітуючий фактор (сірчистий газ, несприятлива температура); латентний період може тривати кілька місяців.
Після цієї фази розмноження відновлюється і викликає бродіння яблучної кислоти. На першому етапі утворення молочної кислоти слабке. Яблучно-молочне бродіння проявляється деякою затримкою розмноження клітин. Розпад яблучної кислоти починається лише тоді, коли зростання досягає логарифмічної фази; воно продовжується під час стаціонарної фази і навіть під час фази уповільнення. Коли популяція слабка, яблучна кислота не споживається. Здається, що розмір популяції повинен перевищувати 1 мільйон клітин на 1 см3, щоб яблучно-молочне бродіння справді почалося. Насправді мова не йде про справжнє бродіння, оскільки воно не є джерелом енергії.
Рис. 12.4. Пристрій, що дозволяє експериментально виявити початок яблучно-молочного бродіння за рахунок утворення бульбашки вуглекислого газу.
Потім, після зникнення яблучної кислоти, популяція зменшується більш-менш швидко, і, нарешті, у вині залишається популяція живих клітин, кількість яких залежить від їх рН, ступеня сульфатації та методів очищення (Martinier та співавтори, 1974).
Щоб простежити еволюцію яблучно-молочного бродіння, в лабораторії використовувався наступний пристрій. Інокульоване живильне середовище або досліджувані вина поміщали в колби місткістю 100 або 200 см3 з довгим тонким каліброваним горлом. Їх заповнюють до градуювальної мітки і покривають товстим шаром суміші, що складається з 2/3 парафіну і 1/3 парафінової олії, яку розріджують легким нагріванням. Потім колби поміщають в термостат при 25 ° С. При цій температурі суміш твердне і зберігає консистенцію пасти. Такий прилад дозволяє спостерігати за бульбашкою вуглекислого газу, що утворюється під парафіновою пробкою, і фіксувати її об’єми, які спричиняють підйом пробки вгору по шийці колби (рис. 12.4). Досліджувані середовища попередньо очищають від вуглекислого газу струшуванням під вакуумом. Потім, щоб уникнути перешкод дріжджів, у вино додають актидіон з розрахунку 2-5 мг/л. Система обтурації надійно працює лише при температурі 25°С.
Цей метод є особливо чутливим для визначення, коли починається яблучно-молочне бродіння, і дозволяє швидко зробити велику кількість порівнянь. Цей метод також застосовний, коли вони хочуть оцінити ймовірність тихого кислого вина зазнати спонтанного яблучно-молочного бродіння; Для цього поміщений у таку колбу зразок шини поміщають у термостат і стежать за появою першого міхура під парафіном. Зникнення яблучної кислоти та титрованої кислотності слід підтвердити аналітично, оскільки утворення вуглекислого газу навіть без участі дріжджів не можна розглядати як явище, характерне для яблучно-молочного бродіння.
Для більш точного моніторингу цього явища можна використовувати вуглекислотний електрод, який дозволяє кількісно визначати вуглекислий газ, розчинений у рідині (Lonvo and Ribero-Guyon, 1973); вуглекислий газ дифундує через тефлонову мембрану в електроліт, викликаючи зміну pH, яка реєструється. Ці автори використовували апарат, призначений для кількісного аналізу вуглекислого газу в крові; Результати, виражені в значеннях парціального тиску, можуть бути представлені як концентрація на літр.
Ще почитати:
Міжнародні відносини о найменуванні шампанського та хереса
В чому різниця між шампанським, просеко та ігристим вином?
Отримання червоних ігристих вин пляшковим способом з винограду перспективних сортів
Ігристі вина
Токайські вина
У нашому блозі «Приватна Марка» багато цікавого контенту: новинки ринку виноробства, крафтові рецепти наших технологів, влоги на різні теми. Дистиляція, крафтові винокурні, виробництво крафтового сидру, крафтовий квас, рецептура сидру, виробництво крафтових напоїв за нашими рецептами, виробництво спирту в промислових масштабах. Це та багато іншого цікавого у блозі «Приватна Марка Україна» та мережі магазинів «Винороб».
Наприклад, ви вирішили відкрити сироварню, ковбасний цех або почати пекти крафтовий хліб — welcome! Ми завжди допоможемо: надамо рецептуру, забезпечимо всі витратні матеріали, відправимо нашого технолога, складемо технологічну карту, встановимо все обладнання, сертифікуємо виробництво, відкриємо для вас завод з нуля, виноробні, цехи, виноградники, налагодимо готовий продукт із виходом на ринок. Ми — компанія повного циклу: маємо багато представництв по всьому світу. Потрібна склотара, склобанки, медичний посуд, лабораторний посуд чи лабораторне обладнання — звертайтеся! У наших складах понад 900 тис. найменувань товарів та обладнання. Звертайтеся, не вагайтеся! Не важливо, де ви знаходитесь — у СНД, Європі, Америці чи Азії: ми маємо великий досвід. Privatna Marka йде в ногу з технологіями та інноваціями. Ми 20 років на ринку та відправили понад 1 млн посилок своїм клієнтам. Втілили багато креативних проєктів. Відкрили низку підприємств харчової промисловості, а також у непродовольчій та продовольчій групах технічних виробів. Втілили 147 комерційних проєктів у країнах СНД. Виробляємо 70 видів продукції власного виробництва в Україні, Німеччині та Китаї. У блозі ще більше цікавого та корисного.
Консультації за тел. +380 (67) 440-70-90
https://privatnamarka.com/
https://www.instagram.com/privatnamarka?igsh=MWt0NzNxbHJrbXh4ZQ==\
https://www.facebook.com/Privatnamarka
https://youtube.com/@privatnamarkacom?si=P5RH_spetEP3x_RQ\