Вивчення генетичних ресурсів українського винограду в рамках міжнародних проектів

Дрісована В. І., к.б.н., старший науковий співробітник відділу біологічно чистих продуктів і молекулярно-генетичних досліджень,
С. М. Гориславець, к.б.н., науковий співробітник відділу біологічно чистих продуктів і молекулярно-генетичних досліджень,
Є. Ш. Меметова, кандидат сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник відділу біологічно чистих продуктів і молекулярно-генетичних досліджень,
Володін В. А., аспірант кафедри біологічно чистих продуктів і молекулярно-генетичних досліджень
Національний інститут винограду і вина «Магарач»

ВИВЧЕННЯ ГЕНЕТИЧНИХ РЕСУРСІВ ВИНОГРАДУ УКРАЇНИ В РАМКАХ МІЖНАРОДНИХ ПРОЕКТІВ

У статті наведено результати роботи лабораторії молекулярно-генетичних досліджень НІВіВ «Магарач» в рамках міжнародних проектів Греція-Україна, IPGRI, ECO-NET, COST FA 1003 та ін., які наочно демонструють досягнення міжнародного співробітництва в галузі молекулярних досліджень винограду.

Ключові слова: виноград, генетичні ресурси, молекулярні маркери, генетична база даних.

Молекулярно-генетичні дослідження сьогодні займають провідне місце в галузі ідентифікації та паспортизації сортів різноманітних культурних рослин. Використання ДНК-технологій значно розширило можливості традиційної селекції винограду, ампелографії та генетики. Тільки ДНК-аналіз, який безпосередньо характеризує генотип, а не його фенотипові прояви, може забезпечити стабільні характеристики сорту, практично придатні для визначення генотипів, сертифікації та реєстрації сортів, виявлення синонімів і омонімів у колекції, захисту авторських прав селекціонерів і захисту продукції рослинництва від можливої ​​фальсифікації. Необхідність контролю за постачаннями посадкового матеріалу, що імпортується та реалізується на внутрішньому ринку, також потребує використання методів ідентифікації за стабільними ознаками, до яких належать методи аналізу ДНК. Використання молекулярних маркерів не залежить від фенотипу, не є тканиноспецифічним, і їх можна використовувати на будь-якій стадії розвитку рослини. Методи генотипування ДНК із застосуванням аналізу мікросателітних локусів або локусів SSR (simple sequence repeate) мають низку переваг перед іншими молекулярними маркерами. Вони характеризуються високим поліморфізмом, кодомінантним типом успадкування, розподілені по всьому геному і дають змогу отримувати унікальні генетичні профілі (молекулярно-генетичні паспорти) досліджуваних зразків, тобто ідентифікувати їх. Ідентифікація методом SSR-PCR базується на визначенні алельного складу мікросателітних локусів досліджуваних зразків (наприклад, сортів) і є підставою для подальшої сертифікації та реєстрації сортів [1, 2].
Технологія «мікросателітного профілювання» активно використовується в європейських лабораторіях для вивчення генетичного різноманіття винограду, а з 2001 року – в лабораторії молекулярно-генетичних досліджень НІВіВ «Магарач». Дослідження розпочато у 2001-2003 роках. під час реалізації двостороннього проекту Греція-Україна: «Розробка мультимедійної веб-бази генетичної бази української, молдавської та російської гермоплазми винограду Vitisvinifera». Проект був спрямований на дослідження генетичних ресурсів винограду в Україні, Росії та Молдові за допомогою молекулярних маркерів. Однією з цілей проекту була розробка методологічних аспектів мікросупутникового профілювання (аналіз SSR) сортів винограду. Частину досліджень проводили в лабораторії фізіології рослин і біотехнології Критського університету, де С.М. Також проходив практику співробітник Інституту Гориславець. Для ідентифікації сортів ми використали методику аналізу SSR, яка базується на генотипуванні певних локусів, які називаються мікросателітами. Для ідентифікації та диференціації було використано 9 мікросателітних локусів: VVS2, SsrVrZAG21, SsrVrZAG47, SsrVrZAG62, SsrVrZAG64, SsrVRZAG79, SsrVrZAG83, UCH 11, UCH 29. У результаті цього проекту створено колекцію зразків ДНК із 109 українською, російською і Молдавські автохтонні сорти винограду. За результатами мікросателітного профілювання отримано унікальні мікросателітні профілі сортів, проведено диференціацію сортів, створено генетичну базу даних, інформаційну базу та ампелографічну базу даних (базу зображень) [3].
Розпочаті дослідження продовжено в рамках міжнародних проектів, що виконуються спільно з європейськими країнами: Люксембург, проект IPGRI (2004-2009), Франція, ECO-NET (2006-2007), Італія, Cost action FA1003 (з 2010 р., рис.). Ці проекти спрямовані на збереження, вивчення та раціональне використання генетичних ресурсів винограду. В рамках цих проектів провідний науковий співробітник. доктор філософії Нарисований В.І., канд. Гориславець С.М. та аспірант Володін В.А. Тренінги проходили у провідних європейських лабораторіях: у лабораторії біотехнологій Центру громадських досліджень (Люксембург), у лабораторії Diversity and Genome (Монпельє) та на Експериментальній станції (Кольмар) Інституту агрономічних досліджень – INRA (Франція), в Інституті ім. Julius Kühn (Siebeldingen, Germany) (Julius Kbhb-Institut (JKI). Досвід, отриманий під час стажування, допоміг у створенні та роботі лабораторії молекулярно-генетичних досліджень в нашому інституті.
З 2003 року інститут представляє Україну в European Grape Working Group. На першому засіданні цієї групи в Паліці (Сербія) у 2003 році було запропоновано шість поліморфних мікросателітних локусів VVS2, VVMD5, VVMD7, VVMD27, VrZAG62 і VRZAG79 як необхідний мінімальний набір для генотипування, ідентифікації, диференціації та класифікації сортів винограду [1]. Згодом у рамках проекту GrapeGen06 (ЄС) кількість мікросателітних локусів було доповнено локусами VVMD25, VVMD28 та VVMD32 [2].
Проект IPGRI (2004-2009) координувався Європейським відділенням Міжнародного інституту генетичних ресурсів рослин (нині Biodiversity International, Рим, Італія), зокрема його директором Йозефом Туроком, і був присвячений вивченню походження культивованого винограду, збереженню та вивченню генетичних ресурсів винограду басейну Чорноморських країн. Проект фінансувався Урядом Герцогства Люксембург і виконувався за підтримки в Програма ECP-GR, яка є спільною багатосторонньою програмою за участю більшості європейських країн, спрямована на забезпечення довгострокового збереження генетичних ресурсів рослин і сприяння їх більш широкому використанню в Європі. У проекті брали участь Італія, Люксембург, Німеччина, а також країни Кавказу та північних регіонів Чорного моря: Азербайджан, Вірменія, Грузія, Республіка Молдова, Російська Федерація та Україна. Генофонд винограду в регіоні між Чорним і Каспійським морями привертає пильну увагу, оскільки... цей регіон є одним з центрів походження і вирощування євразійського винограду. Основними напрямками діяльності проекту є ідентифікація, збір, характеристика та збереження генофонду винограду, розширення використання національних генетичних ресурсів країн-учасниць. У рамках проекту створено єдину базу даних сортів винограду, яка включає понад 2600 сортів, у т.ч. аборигенні сорти та дикі форми. У співпраці з Міланським університетом та Науковим центром Габріеля Ліпмана (Люксембург) за допомогою молекулярних маркерів ідентифіковано деякі місцеві сорти Грузії та України [4, 5]. З метою збереження генофонду створено нові колекції місцевих сортів в Азербайджані, Вірменії, Грузії та Російській Федерації. У 2004 році НІВіВ «Магарач» був організатором другої робочої зустрічі з цього проекту, за результатами якої було підготовлено збірник статей учасників зустрічі [6]. У рамках проекту IPGRI у 2006 році інститут виграв грант на фінансування створення лабораторії молекулярно-генетичних досліджень. Керівник гранту – к.т.н., зав. лабораторія. МГІ Накреслено В.І.
Першу робочу зустріч за проектами ECO-NET і GrapeGen06 (ЄС) організував Роберто Бачільєрі з Французького інституту сільськогосподарських досліджень (INRA), яка відбулася в листопаді 2006 року в Монпельє (Франція). В результаті було започатковано науковий проект ECO-NET: «Генетичні ресурси культурного та дикого винограду, опис, оцінка та використання старих сортів і диких генотипів». Головна мета проекту – створити скоординовану модель збереження генетичних ресурсів. У рамках проекту учасники домовилися про взаємний обмін зразками різних форм винограду (дикі види, сорти, селекційні сорти, клони тощо) та про спільне дослідження різних форм винограду з використанням молекулярних маркерів. Програма ECO-NET фінансувалась Міністерством сільського господарства Франції. Під час зустрічі обговорювалися питання співпраці в рамках цих проектів. У результаті було окремо ініційовано угоду про науково-технічну та культурну співпрацю між НІВіВ «Магарач» та INRA. Програма зустрічі включала відвідування відомої європейської ампелографічної колекції винограду «Вассал» (UEDV), Селекційного центру та колекції клонів Національного центру вдосконалення виноградарства (ENTAV). ENTAV та INRA є центрами отримання та сертифікації клонів у Франції. Учасників ознайомили з науковими дослідженнями, які проводяться в лабораторії «Різноманітність і геном культурних рослин» INRA: дослідження геному винограду за допомогою молекулярних маркерів, методами культур клітин і тканин, кріогенного консервування тощо.
Для кращого розуміння процесу вирощування винограду в рамках міжнародного співробітництва у 2003-2005 рр. Проаналізовано поліморфізм геному хлоропластів у сортах винограду та диких формах Vitis sylvestris, що ростуть навколо Середземного моря. Спільними дослідженнями керував професор Хосе Мартінес Сапатер з Національного центру біотехнології (Мадрид, Іспанія). Досліджено 10 мікросателітних локусів хлоропластів винограду. Лише три використані локуси виявилися поліморфними та були використані для характеристики гаплотипів хлоропластів понад 500 столових і винних сортів винограду, що вирощуються в Середземномор’ї, а також понад 100 диких форм Vitis. У рамках цього дослідження в лабораторії молекулярно-генетичних досліджень досліджено поліморфізм геному хлоропластів 48 кримських, 27 молдавських і 24 російських автохтонних сортів винограду, що ростуть в ампелографічній колекції НІВіВ «Магарач» [7]. Результати спільного дослідження показали існування принаймні двох основних центрів акультурації, один на Близькому Сході та другий у Західній Європі, які дали початок багатьом західноєвропейським сортам винограду [8].
З 2010 року співробітники лабораторії Інституту МГІ беруть активну участь у міжнародному проекті COST Action FA1003 GRAPENET - «Співпраця між Заходом і Сходом для вивчення різноманітності виноградної лози та мобілізації адаптивних ознак для селекції». Система грантів COST забезпечує фінансування зустрічей Проекту COST, короткотермінових наукових місій (STSM), навчальних шкіл тощо. Дослідження цього проекту спрямовані на об’єднання зусиль дослідників із країн Східної та Західної Європи для вивчення в широкому географічному масштабі генофонду виноградної лози в ряді країн географічного різноманіття та мобілізації адаптивних ознак з метою селекції та сталого використання цієї цінності. садово-городня культура. Особливу увагу приділено вивченню генетичних ресурсів винограду в передбачуваному регіоні його вирощування (Південно-Східна Європа і особливо Кавказ), а також на шляхах міграції народів.
Проект співпрацює на міжнародному рівні між селекціонерами та науковцями, щоб отримати знання про це цінне різноманіття, його моделі, процеси та кореляції з такими ознаками, як стійкість і якість плодів. Обмін досвідом, спільна відповідальність та спільний доступ до інформації та матеріалів для розробки методів фенотипування BBCH та асоціаційно-генетичних досліджень у основних колекціях значно посилять вплив досліджень, які проводять кожен партнер, і виведуть інноваційні напрямки досліджень на європейський рівень. В результаті реалізації даного проекту в лабораторії НІВіВ «Магарач» створено банк даних за результатами фенологічного спостереження та агробіологічної характеристики 52 сортів винограду за шкалою BBCH, а також за результатами енохімічного та енокарпологічного аналізу сортів винограду за шкалою BBCH. Таким чином, цей проект зробить довгостроковий внесок у покращення знань про виноград, його довготривале збереження та покращення якості виноградної продукції в Європі.
У дослідженнях лабораторії МГІ як матеріал для вивчення генетичного різноманіття винограду використовувалися не тільки аборигени Криму, Молдавії та Росії, а й селекційні сорти та їх батьківські форми, сорти, зареєстровані в Державному реєстрі України, дикорослі форми винограду. Деякі сорти були проаналізовані в 9 мікросателітних локусах, рекомендованих Європейською базою даних винограду. Деякі сорти були вивчені з використанням 23 локусів SSR.

Рис. Наукове співробітництво в рамках міжнародних проектів

вказуються нижніми індексами біля назви мікросателітного локусу.
На основі отриманих мікросателітних профілів проводиться атестація сортів. У рамках спільних європейських проектів GenRes 081/1994-2002 та GrapeGen06 (EC) розроблено стандарт маркування генотипів винограду за допомогою еталонних алельних кодів, які
CH1CH2 VVMD7CF1TR1
VVMD25CS1CF2 VVMD27CF1CS2
VVMD28chich2 VVMD32 cs1mu2 VrZAG62 chich2 VrZAG79CH1CH2.
Однак універсальний варіант кодування розмірів алелей
ВВС2Ч1Ч2 ВВМД5
мікросателітних локусів визнано варіант «n+x», який пропонується як основний запис формул генотипу (молекулярно-генетичних паспортів) винограду на основі аналізу мікросателітних локусів [1]. Так, наприклад, коди генотипів наших вітчизняних сортів записуються в такому вигляді:
Асма
VVS2 n+12n+14 VVMD5 n+4n+14 VVMD7 n+12 n+18 VVMD27n+10 n+14 VrZAG62n+26 n+26 VRZAG79n+10 n+14
Капсельський
VVS2 n+20 n+26 VVMD5 n+6 n+14 VVMD7 n+8 n+22 VVMD27n+4 n+8 VrZAG62n+26 n+30 VRZAG79 n+12 n+14
Кокур білий
VVS2 n+22 n+22 VVMD5 n+6 n+16 VVMD7 n+8 n+18 VVMD27n+12 n+14 VrZAG62n+26 n+26 VRZAG79 n+14 n+15
Запропонована система позначення алелів і запису генотипів винограду (молекулярно-генетичні паспорти) дозволяє конвертувати отримані мікросателітні профілі у форму, зручну для порівняння результатів, отриманих у різних лабораторіях, у різних країнах і на приладах різних марок.
За результатами ДНК-типування ми створили молекулярно-генетичні паспорти на понад сотню сортів винограду, які разом із інформацією про родовід та основні ампелографічні ознаки можуть бути використані як найточніша система сертифікації в державних стандартах реєстрації сортів. Молекулярно-генетичні паспорти як елемент реєстрації сортів дають змогу підвищити рівень захисту інтелектуальної власності. Вони також можуть бути використані при вивченні вихідного матеріалу в селекції, встановленні оригінальності та генетичної однорідності сорту при державному сортовипробуванні, а також при оцінці сортової автентичності та чистоти садивного матеріалу. Це також актуально при контролі якості та оцінці справжності сортових вин. Молекулярно-генетичні паспорти досліджуваних нами зразків винограду були об’єднані в базу даних. Встановлено можливість експрес-оцінки гібридних сіянців на ранній стадії розвитку, оцінки стабільності мікросателітних профілів генотипів винограду після їх тривалого культивування in vitro.
В Україні особлива увага приділяється якості садивного матеріалу винограду. У зв'язку з цим в лабораторії молекулярно-генетичних досліджень інституту проводиться перевірка латентної стадії бактеріальних і вірусних інфекцій винограду. Дослідження проводяться відповідно до міжнародних стандартів. В рамках виробництва сертифікованого матеріалу для сортів винограду та підщеп проводиться тестування методами ПЛР та ІФА латентної стадії вірусної та бактеріальної інфекції садивного матеріалу сортів Каберне Совіньйон, Чорний Піно, Зелений Совіньйон, Кобер 5-ВВ, Мерло, Шардоне, Мускат Оттонель, Красень, Подарок Магарача, Бастардо та ін. ведеться пошук маркерів, тісно пов'язаних з економічно цінними генами (MAS-селекція).
Результати, отримані в рамках цих проектів, яскраво демонструють досягнення міжнародного співробітництва в галузі молекулярних досліджень винограду.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

Ще почитати:

Міжнародні відносини о найменуванні шампанського та хереса

В чому різниця між шампанським, просеко та ігристим вином?

Отримання червоних ігристих вин пляшковим способом з винограду перспективних сортів

Ігристі вина

Токайські вина

У нашому блозі «Приватна Марка» багато цікавого контенту: новинки ринку виноробства, крафтові рецепти наших технологів, влоги на різні теми. Дистиляція, крафтові винокурні, виробництво крафтового сидру, крафтовий квас, рецептура сидру, виробництво крафтових напоїв за нашими рецептами, виробництво спирту в промислових масштабах. Це та багато іншого цікавого у блозі «Приватна Марка Україна» та мережі магазинів «Винороб».

Наприклад, ви вирішили відкрити сироварню, ковбасний цех або почати пекти крафтовий хліб — welcome! Ми завжди допоможемо: надамо рецептуру, забезпечимо всі витратні матеріали, відправимо нашого технолога, складемо технологічну карту, встановимо все обладнання, сертифікуємо виробництво, відкриємо для вас завод з нуля, виноробні, цехи, виноградники, налагодимо готовий продукт із виходом на ринок. Ми — компанія повного циклу: маємо багато представництв по всьому світу. Потрібна склотара, склобанки, медичний посуд, лабораторний посуд чи лабораторне обладнання — звертайтеся! У наших складах понад 900 тис. найменувань товарів та обладнання. Звертайтеся, не вагайтеся! Не важливо, де ви знаходитесь — у СНД, Європі, Америці чи Азії: ми маємо великий досвід. Privatna Marka йде в ногу з технологіями та інноваціями. Ми 20 років на ринку та відправили понад 1 млн посилок своїм клієнтам. Втілили багато креативних проєктів. Відкрили низку підприємств харчової промисловості, а також у непродовольчій та продовольчій групах технічних виробів. Втілили 147 комерційних проєктів у країнах СНД. Виробляємо 70 видів продукції власного виробництва в Україні, Німеччині та Китаї. У блозі ще більше цікавого та корисного.

Консультації за тел. +380 (67) 440-70-90
https://privatnamarka.com/
https://www.instagram.com/privatnamarka?igsh=MWt0NzNxbHJrbXh4ZQ==\
https://www.facebook.com/Privatnamarka
https://youtube.com/@privatnamarkacom?si=P5RH_spetEP3x_RQ\