Біотехнологічні методи формування банку здорових рослин та збереження генофонду винограду in vitro

УДК 634.8. 037
БІОТЕХНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ФОРМУВАННЯ БАНКУ ЗДОРОВИХ РОСЛИН ТА ЗБЕРЕЖЕННЯ ГЕНОФОНДУ ВИНОГРАДУ IN VITRO
Н.П. Дорошенко, А.А. Соболєва Державна наукова установа Всеросійський науково-дослідний інститут виноградарства і виноробства ім. Я.І. Потапенко,
Новочеркаськ
Основні напрямки досліджень в галузі біотехнології у ВНІІВіВ ім. Я.І. Потапенка, серед яких особлива увага приділяється оздоровленню рослин від хронічних хвороб та отриманню базового садивного матеріалу класу А для посадки базових маточників і переведення виноградарства на сертифіковану основу.
Загальні тенденції розвитку світової економіки визначають роль біотехнології як рушійної сили науково-технічного прогресу. У національних програмах провідних країн світу біотехнологія є однією з пріоритетних галузей, що відображає рівень соціально-економічного стану суспільства.
Використання біотехнології потенціалу живих організмів в інтересах господарської діяльності дозволяє вирішувати проблеми, пов'язані з нестачею продовольства, виснаженням природних енергетичних запасів, запобіганням забрудненню навколишнього середовища, збереженням біологічного різноманіття, діагностикою та лікуванням особливо небезпечних захворювань та інші проблеми.
Другий міжнародний конгрес, який відбувся в 2003 році в Москві [1], визначив основні сучасні напрямки розвитку біотехнології, серед яких відзначено важливість біотехнології для поліпшення якості життя і середовища проживання, забезпечення повноцінного харчування населення. Останнє має безпосереднє значення для виноградарства.
Дослідження з біотехнології почалися у ВНІІВіВ ім. Я.І. Потапенка в 1983 р. Нині вони здійснюються за такими напрямками:
- оздоровлення рослин від вірусів, мікоплазм, бактеріального раку та клонове мікророзмноження перспективних сортів винограду;

Розробляються також нетрадиційний метод селекції винограду на безнасінність, методи підвищення та збереження життєздатності пилку безнасінних сортів винограду; технологія створення колекцій винограду in vitro.
Основою довговічності та рентабельності багаторічних насаджень є інноваційні процеси розсадництва винограду, спрямовані на отримання високоякісного садивного матеріалу з використанням біотехнологій. У зв'язку з цим цій сфері приділяється особлива увага.
Максимальної продуктивності рослин винограду можна досягти при відсутності зараження найнебезпечнішими вірусами, фітоплазмами, грибковими, бактеріальними захворюваннями, нематодами та іншими шкідниками.
Як випливає з огляду П. Абрашевої [2], віруси, розмножуючись у клітинах рослин і використовуючи їх для свого розмноження, викликають порушення метаболізму хазяїна, що призводить до затримки росту пагонів. Пригнічення росту і поступове зменшення надземних частин уражених вірусами рослин винограду аж до їх повної загибелі – найпоширеніший симптом, на який звертають увагу дослідники, які працювали і працюють у цій галузі. Порушуючи перебіг фізіологічних процесів, віруси в кінцевому підсумку впливають на кількість і якість продукції. У столових сортів зниження якості унеможливлює використання їх для споживання у свіжому вигляді, а з винних сортів дають нетипові для сорту вина. Хворі рослини, крім того, сильно страждають від несприятливих умов середовища. Ослаблені кущі часто передчасно всихають, що викликає раннє проріджування виноградників.
Оздоровлення рослин проводять з використанням культури апікальних меристем з відносним розміром експлантату 0,1-0,2 мм, оскільки встановлено, що дрібні експланти найкраще підходять для знищення вірусів. Для підвищення низької регенераційної здатності таких експлантів розроблено оригінальну технологію мікроклонального розмноження, захищену патентами. Він складається з таких послідовних етапів: виділення експлантів (центральних бруньок бруньок) і отримання асептичної культури in vitro, виділення апікальної меристеми, індукція утворення адвентивного пагона, укорінення пагонів, отримання пробіркових рослин, висаджування рослин-регенерантів у ґрунтовий субстрат.
Ключовим моментом технології є регенерація цілої нормальної життєздатної рослини. Успіх культивування in vitro та отримання нормальних рослин безпосередньо пов’язані з оптимізацією умов на кожному етапі технології. Як правило, навіть невеликі відхилення від оптимуму призводять до різкого зниження темпів росту і розмноження, а також погіршення фізіологічного стану регенерантів.
З метою оптимізації процесу загоєння рослин уточнено вміст цигокініну 6-BAP на вхідній стадії, розроблено метод підвищення регенераційної здатності меристем шляхом впливу на них електромагнітного опромінення низької інтенсивності (мікрохвильові промені) у поєднанні з вузькосмуговим лазером [3], а також доведено перспективність використання нового фіторегулятора емістим [4].
Метод комбінованої обробки меристем електромагнітним полем (ЕМП) надвисокої частоти (мікрохвильові промені) та вузькосмуговим лазером заснований на модифікації та зміні проникності клітинних мембран під впливом мікрохвильових променів, що призводить до посилення надходження поживних речовин, води та кисню та активує ферментні метаболічні системи (табл. 1).
Таблиця 1
Регенераційна здатність меристем при різній тривалості комплексного опромінення

Як випливає з наведених даних, при опроміненні меристем протягом 75 хвилин зростає середній і максимальний розміри меристем, зменшується їх загибель від некрозу, кількість зрізаних мікропагонів на ізольовану меристему збільшується з 0,8 у контролі до 4,4 шт., тобто регенеративна здатність меристем зростає в 5,5 раза.
Особливе значення має використання препарату емістим на етапі введення меристем в культуру тканин. Меристеми розміром 0,1-0,2 мм, ізольовані та висаджені на живильне середовище, потребують захисту від стресу та патогенів, стимуляції поділу клітин для їх росту та посилення проліферації (нового утворення вузлів і пагонів) на наступному етапі самого мікророзмноження. Таким чином, емістим позитивно впливає на підвищення регенераційної здатності: покращується як виживаність, так і продуктивне відновлення меристем.
Оптимізації клонального мікророзмноження на стадії мікрозрізання пробіркових рослин сприяє використання мікрохвильових променів [5], рослинної добавки з дрібно подрібнених кісточок винограду [6] та внесення в живильне середовище 6-БАП [7]. Під впливом мікрохвильових променів добова швидкість росту збільшується в 1,7-2,4 раза, маса рослини в 2 рази, довжина пагона в 1,7 раза, кількість утворених вузлів в 1,2-1,5 раза. При додаванні в живильне середовище природних стимуляторів росту з кісточок винограду ефективність клонального мікророзмноження підвищується на 27,4 % (табл. 2).

Вплив природних стимуляторів з кісточок винограду на показники розвитку рослин на стадії мікрорізання

У процесі досліджень розроблено та вдосконалено методи, спрямовані на покращення регенерації рослин, такі як: стерилізація вихідних експлантів, боротьба з хронічною інфекцією, оптимізація поживних середовищ, оптимізація клонального мікророзмноження на етапах проліферації та мікрорізання, адаптація рослин до нестерильних умов.
Для комплексного оздоровлення рослин від вірусів, вірусоподібних захворювань та мікоплазм розроблено спосіб водолікування визрілих мікрочеренців з подальшим культивуванням апікальних меристем (табл. 3).
Уточнено режими обробки з метою забезпечення приживлюваності, продуктивного відновлення та оздоровлення ряду сортів винограду: Степняк, Сапераві північний, Цвєточний, Фіалковий ранній, Запашний, Московський стійкий. Після водної терапії всі досліджувані сорти зберегли життєздатні меристеми. Однак при деяких режимах лікування відсутні як виживання меристем, так і їх регенерація. Ці режими: 45 °C, 10 хвилин; 50 °C, 10 хвилин; 55 °C, 45 хвилин; 55 °C, 60 хвилин; 55 °C, 75 хвилин. Вони не підходять для водної терапії. Оптимальними режимами, які забезпечують високу репаративну та продуктивну регенерацію меристем, є: температура води 45 °С, експозиція 45 хв і температура води 55 °С, експозиція 30 хв [8].

Таблиця 3
Регенеративна здатність меристем за різних режимів водолікування

Результати дослідження фітогормону емістим свідчать, що цей препарат позитивно впливає на ріст меристематичних тканин, ростові процеси пробіркових рослин, зменшує вплив несприятливих і стресових факторів, підвищує стійкість до патогенів. Виробничі випробування, проведені на сорті Північне Каберне, показали, що завдяки емістиму адаптація пробіркових рослин до нестерильних умов покращується на 95-100%.
Таким чином, розроблено методи підвищення регенераційної здатності меристем і, як наслідок, ефективності оздоровлення рослин винограду від вірусної інфекції, що підтверджено тестуванням на трав’яних індикаторах та за допомогою полімеоазної ланцюгової реакції (ПЛР).
З метою підвищення ефективності оздоровлення та клонового мікророзмноження винограду вивчали мінімальні параметри інтенсивності та тривалості освітлення, необхідні для формування якісних мікроклонів, а також чутливість винограду in vitro до освітлення різної якості [9].
Встановлено, що на етапі введення в культуру оптимальним для розвитку меристем виявилося освітлення 1800-2000 лк. На етапі мікрочеренкування пагонів сортів Дружба, Цимлянський чорний, Ріхтер 110 якісні мікроклони у цих сортів розвивалися при освітленості 2900-3200 лк, а у сорту Цвєточний – 1600-1700 лк. Також встановлено, що рослини мають адаптивну здатність до низької інтенсивності освітлення при пересадці в нестерильні умови середовища. Найкращою енергетичною освітленістю для розвитку рослин сорту Феркал виявилася інтенсивність 1700-1900 лк [10].
У результаті дослідження було запропоновано замінити традиційний довгоденний фотоперіод (16 годин) на коротший (14 годин) для сортів Цимлянський чорний і Феркал. При структурі фотоперіоду 16-1 год спостерігалася найбільша кількість відбракованих рослин. Тривалість освітлення 12 годин може затримати розвиток мікроклонів.
Для посилення росту пагонів на етапах мікрозрізання та адаптації до нестерильних умов можна використовувати освітлення низької інтенсивності з переважанням променів, максимум яких знаходиться в помаранчевій області спектра (611 нм). Освітлення експлантів і адаптованих рослин променями синього спектрального складу (450 нм) надає на них дію, близьку за якістю до природного освітлення.
Для підвищення імунітету та активізації ростових процесів ефективне застосування фіторегулятора росту емістиму в концентраціях 1012 і 10-10% при інтенсивності потоку випромінювання 2200-2400 лк. При освітленості 1600-1700 лк для стимуляції ростових процесів можна використовувати маніт у концентрації 6 мг/л [11].
Розроблено спосіб адаптації здорових пробірних рослин винограду до нестерильних умов навколишнього середовища, що забезпечує високий урожай адаптованих рослин [12], методи висадки здорових вегетуючих саджанців у плівку, стаціонарні теплиці та відкритий ґрунт [13].
Покращені сорти винограду накопичують у колекції і використовують для посадки маточників. Раніше ми висаджували маточники в плівкових, стаціонарних теплицях і відкритому грунті в агрохолдингах ВНІІВіВ і в шести виноградарських господарствах Дону. В даний час розпочато роботу зі створення центру попереднього розмноження основного садивного матеріалу класу А в Нижньо-Кундрюченском відділенні дослідного поля ВНІІВіВ ім. Я.І. Потапенко.
Ідеальною альтернативою або доповненням до польового збору є зберігання винограду in vitro у вигляді вирощування колекцій періодично субклонованих рослин. Для цього розроблені способи зберігання при низьких плюсових температурах і освітленості з використанням інгібіторів росту та осмотики.
При додаванні в живильне середовище сорбіту термін зберігання 4 місяці. Тривалість вирощування без пересадки при низьких плюсових температурах і освітленості 6 місяців. Такий самий результат було отримано при додаванні до живильного середовища хлорхоліну хлориду та 6-БАП при потрійному вмісті сахарози.
Для закладення рослин винограду вперше використано природні інгібітори [14]. Додавання насіння у високих концентраціях до живильного середовища (1,0% порошку насіння дрібного помелу або 20% екстракту) створює в ньому такий рівень природних інгібіторів, при якому спостерігається зниження ростових процесів і вдається збільшити часові інтервали між пересаджуванням рослин на свіже живильне середовище в 4-5 разів.
Запропоновано нові умови тривалого зберігання генофонду винограду: до 10-12 місяців і більше без пересадки за рахунок використання модифікованого для зберігання поживного середовища Мурасіге і Скуга, температура 4 °С і освітленість 0,3-0,5 тис. люкс [15]. Виявлено можливість збереження рослин без пересадки протягом 210-240 днів, використовуючи живильне середовище для тривалого зберігання і знижуючи освітленість до 400-500 лк, без зміни температурних параметрів [11].
Розроблено технологію створення генофонду винограду in vitro, яка включає:

Таким чином, дослідження, проведені в лабораторії біотехнології, свідчать про велике практичне значення методу клонового мікророзмноження для оздоровлення рослин винограду від вірусної інфекції та отримання садивного матеріалу вищих категорій якості, тривалого утримання та збереження цінних генотипів.

Література

9. Соболєв А.А. Обґрунтування світлобіотехнологічних прийомів клонального мікророзмноження винограду // Автореф. дис. ...канд. біол. Sci. - Краснодар, 2004. - 25 с.

За матеріалами конференції: Сучасні досягнення біотехнології у виноградарстві та інших галузях сільського господарства, Новочеркаськ, 29-30 червня 2005 р. / ГНУ ВНІІВіВ ім. Я.І. Потапенко.