Товарів: 0
На суму: 0 грн
УДК 634.8:581.143.6
БІОТЕХНОЛОГІЯ ВИРОБНИЦТВА ЗДОРОВОГО ПОСАДАЧНОГО МАТЕРІАЛУ ВИНОГРАДУ В КАЗАХСТАНІ
Долгих С.Г
ТОВ «Казахський науково-дослідний інститут плодівництва і виноградарства», м. Алмаги, Казахстан; Електронна пошта: [email protected]
Дослідження присвячені діагностиці вірусних хвороб винограду, оздоровленню культурою тканин та клональному мікророзмноженню винограду. Розпочато дослідження генетичного моніторингу мікроклонованих рослин винограду методом 1SSR-PCR.
Відповідно до Програми інноваційного розвитку промисловості Казахстану до 2015 року біотехнологія визначена пріоритетним напрямком розвитку економіки держави, головною роллю якого є визначення перспективних напрямків наукових досліджень відповідно до першочергових потреб сільськогосподарського виробництва. При цьому важливим аспектом є спрямованість прикладних розробок на насичення ринку конкурентоспроможною імпортозамінною біотехнологічною продукцією для сільського господарства.
Однією з найприбутковіших підгалузей сільськогосподарського виробництва є виноградарство. Проте площа виноградників у республіці скоротилася більш ніж удвічі порівняно з 80-ми роками минулого століття [1]. Посадка нових промислових виноградників високопродуктивними безвірусними клонами допоможе відродити галузь. Для цього необхідно закладати суперелітні маточники перспективних сортів, яких зараз немає в Казахстані. Останнім часом товариства з обмеженою відповідальністю, фермерські господарства та орендні групи виявляють значний інтерес до високоякісного садивного матеріалу перспективних сортів винограду, а переробна промисловість відчуває гостру потребу у місцевій сировині. Для прискореного виробництва садивного матеріалу нових затребуваних виробниками сортів винограду ефективним є метод мікроклонального розмноження in vitro, якому поки що немає рівних завдяки високій швидкості розмноження, можливості вирощувати рослини цілий рік у контрольованих умовах, планувати виробництво та швидко реагувати на зміну потреб ринку. Виникла необхідність прискореного розмноження генотипів винограду за господарсько-цінними ознаками біотехнологічними методами та висаджуванням суперелітних маточників.
Головною метою мікророзмноження є отримання генетично стабільних рослин, що є важливою умовою збереження клонової чистоти. Проте в природі існує сортова клонова мінливість і мінливість, що формується в результаті випадкових мікромутацій геному при культивуванні рослинних тканин in vitro. Ці зміни часто передаються у спадок і тому небажані при клональному розмноженні. Тому структура розробок з клонального мікророзмноження останнім часом змінилася і зросла увага до молекулярних технологій, покликаних підвищити ефективність генетичної реалізації сільськогосподарської продукції. рослини. Це включає використання технології ДНК. Створення ДНК-маркерів успішно використовується в ДНК-генотипуванні для ідентифікації сортів і створення практичних технологій реєстрації та сертифікації, важливих у сільському господарстві. сільськогосподарських культур, у тому числі винограду [2, 3, 4, 5, 6].
На основі цього в 2009 році біотехнологічна лабораторія розпочала дослідження з генетичного контролю рослин винограду в процесі багаторічного мікроклонального розмноження з метою отримання сертифікованого високоякісного садивного матеріалу. Об’єктами дослідження були шість перспективних сортів винограду, виділених за господарсько-цінними ознаками та затребуваних у виробництві: Ілійський, Сапераві, Аліготе, Алмали та Береке, що вирощуються в колекційній зоні Помологічного саду.
Обстеження виноградників на півдні і південному сході Казахстану, проведені в 2006-2008 роках, показали наявність ряду вірусних захворювань, в тому числі патогенних: інфекційного хлорозу, жилкової мозаїки, жовтої мозаїки, облямування жилок, мармуровості і короткого сучка. Одужання від вірусної інфекції проводили методом мікроклонального розмноження.
Ми розробили біотехнологію мікроклонального розмноження винограду in vitro та отримання вільного від вірусних та мікоплазмових інфекцій посадкового матеріалу винограду. Розроблений регламент включає наступні етапи. Візуально відбирали чистосортові, високопродуктивні та зовні здорові кущі винограду відповідно до ампелографічних ознак сорту, розвитку кущів, характеру плодоношення та якості врожаю. З явно безсимптомних кущів готували живці розміром 15-20 см, проводили стратифікацію, а потім з цих живців отримували вегетативні пагони, верхівкові меристеми яких вводили в культуру тканин (березень-травень). Розмір оптимальних експлантів для розмноження винограду становив 0,5-2,0 мм. Експланти культивували в рідкому живильному середовищі з цитокініном – 6 бензиламінопурином (6БАП). Живильне середовище включало макро- та мікросолі за Мурасігою та Скугом, подвійну кількість хелату заліза; вітаміни: аскорбінова кислота -1 мг/л, тіамін -10 мг/л, піридоксин - 5,5 мг/л, нікотинова кислота - 4,5 мг/л, параамінобензойна кислота - 5 мг/л, мезоінозит (75 мг/л); амінокислоти: гліцин (10 мг/л), глутамін (50 мг/л); вуглеводи: сахароза (30 г/л) та регулятори росту: цитокінін 6-БАП -1 мг/л.
Перед введенням у культуру тканин виноградні верхівки стерилізували з використанням триклозану в милі, діоциду та активного хлору в мийному засобі.
Послідовна стерилізація бруньок винограду в період їх виходу зі стану спокою триклозаном і діоцидом забезпечувала 100% ліквідацію зараження. Хлор був 100% ефективним у стерилізації вегетативних зелених пагонів. При культивуванні верхівкових меристем винограду на рідкому живильному середовищі через 30 днів вони збільшувалися в розмірах до 1-2 см. Їх повторно пасажували на рідкому живильному середовищі і, коли пагони винограду досягали довжини 4 см з 6-8 бруньками, розрізали на 2-3 мікрочерешки з однією-двома вічками і культивували кожен на свіжому живильному середовищі. Далі пасажування проводили кожні 2 тижні з коефіцієнтом розмноження 1:20. Клонування продовжували до 5 пасажів, щоб уникнути генетичних аномалій. Потім пагони довжиною понад 1 см укорінювали в модифікованому рідкому живильному середовищі до утворення коренів. Перші два тижні після переведення рослин винограду з in vitro в in vivo умови створювали підвищену вологість. Кращий час для перенесення рослин в теплицю - березень-квітень. Восени, ближче до кінця вегетації, сіянці виросли до стандартних розмірів; після опадання листя викопували і зберігали в холодильнику до висадки в маточний розчин.
Для вирішення проблеми генетичного контролю рослин винограду в процесі тривалого мікроклонального розмноження нами теоретично та частково практично опрацьовано питання виділення ДНК рослин за допомогою набору NucleoSpin Plant II (Macherey Nagel Gmbh, Німеччина). Визначення концентрації ДНК у розчині спектрофотометричними методами. Розрахунок параметрів та проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням праймерів ISSR (Inter Simple Sequence Repeats): Ml - (ACA CAC)3 CCG; M2 - (ACA CAC)3 C(C/T)G; M3 - (GAG AGA)3 A(C/T)C; M4 - (AGA GAG)3 G(C/T)C; M5 - (ATA TAT)3 T; M6 - (CAC)S; M7 - (CAG)5; M8 - (GTG)5; M9 - GAC ACG ACA CGA CAC GAC AC; M10 - (CAC ACA)2 (A/G)G; Ml 1 - (CAC ACA)2 (A/G); M12 - (CAC ACA)2 (A/G)(C/T); M13 - (AGC)4 (S/T); M14 - GAC AGA CAG ACA GAC A; UBC 840 - (GAG AGA)3 AAY T; UBC855 - (ACA CAC)3 CCY T; UBC868 - (GAA)6; UBC881 - GGG TGG GGT GGG GYG. Поділ продуктів ПЛР в агарозних гелях. Аналіз агарозних гелів і складання бінарних матриць на наявність/відсутність ампліконів. Аналіз отриманих результатів за допомогою комп’ютерних програм PAST, TreeCon та NewHybrids. Встановлено достатню інформативність та надійність маркерів ISSR у молекулярно-генетичних дослідженнях винограду.
Література
За матеріалами Міжнародної науково-практичної конференції «Науково-прикладні аспекти розвитку виноградарства і виноробства на сучасному етапі» - Новочеркаськ, ВНИИВиВ ім. Я.І. Потапенко, 2009
