Методи біотехнології в селекції безнасінних сортів винограду

УДК 634.8: 631.527
МЕТОДИ БІОТЕХНОЛОГІЇ В СЕЛЕКЦІЇ БЕЗНАСІДОЧНИХ СОРТІВ ВИНОГРАДУ
Бернікова Н.В
Всеросійський науково-дослідний інститут виноградарства і виноробства ім. Я.І. Потапенко, Новочеркаськ
Запропоновано спосіб отримання вихідного матеріалу для селекції із ізольованих семязачатків безнасінних сортів винограду методами біотехнології.
У 21 столітті все більше необхідно враховувати несприятливий вплив таких факторів, як глобальна енергетична криза, що розвивається, і кліматичні зміни в світі, які можуть спричинити підвищення рівня стресу для живих організмів. У таких умовах біологічні та біофізичні дослідження, спрямовані на селективне поліпшення сільськогосподарських культур, стабільність виробництва та зменшення втрат, набувають ще більшого значення, ніж у минулому. Стало очевидним, що найбільш надійним і економічно ефективним фактором підвищення продуктивності та її стабільності є сорт. Залежність збільшення виробництва від сорту невпинно зростає.
Створення продуктивних сортів стало можливим за допомогою нових біотехнологічних методів поліпшення рослин (генної, хромосомної, клітинної інженерії) у поєднанні з вдосконаленими методами класичної селекції. Це відкриває нові можливості для цілеспрямованої модифікації посівів та підвищення їх стійкості, продуктивності та якості [1].
Одним із напрямів клітинних технологій є їх використання в селекції, що полегшує і прискорює традиційний селекційний процес при створенні нових форм і сортів рослин. Існуючі методи культивування ізольованих клітин і тканин in vitro можна розділити на дві групи.
Перша група — це допоміжні технології, які не замінюють традиційну селекцію, а обслуговують її. До них відносяться: запліднення in vitro (подолання прогамної несумісності), культивування яйцеклітин і незрілих гібридних ембріонів (подолання постгамної несумісності), отримання гаплоїдів шляхом культивування пиляків і мікроспор, кріоконсервація ізольованих клітин, тканин і органів, клональне мікророзмноження гібридів.
Друга група методів веде до самостійного отримання нових форм і сортів рослин, незалежних від традиційних методів селекції: відбір клітин за допомогою калюсної тканини, соматична гібридизація (злиття ізольованих протопластів і отримання нестатевих гібридів), використання методів генної інженерії [2].
В результаті широкого використання культури ізольованих зародків і яйцеклітин в дослідженнях, пов'язаних з селекційним процесом, різними авторами отримано багато цінних для практики форм рослин, які неможливо отримати звичайними методами. Серед інших, до них відноситься виноград без кісточок.
Серед майже 30 тисяч сортів, які, за останніми даними, включають світові колекції винограду, особливе місце займають безнасінні сорти, що пояснюється їх високою практичною цінністю як у виробництві сушеної продукції, так і для споживання у свіжому вигляді, а також у приготуванні вин, соків та інших харчових продуктів.
Серед великої кількості відомих і описаних сортів група безнасінних дуже невелика (близько 2%) і представлена переважно дрібноягідними формами виду V. vinifera L. східної групи Orientalis Negr., придатних для вирощування в регіонах з теплим кліматом, високою сумою активних температур і тривалим вегетаційним періодом (райони Середньої Азії, Ірану, Туреччини, Афганістан тощо). У Росії лише деякі регіони Південного Дагестану придатні для вирощування безнасінних сортів винограду.
Безнасінних сортів в російському асортименті практично немає. Тому для нашої країни актуальним є створення нових безнасінних сортів, які мають цінні біологічні та господарські властивості в поєднанні з коротшим вегетаційним періодом, стійкістю до морозів та філоксери.
Основним методом одержання нових сортів у безрозсадній селекції вже понад 100 років є гібридизація. В результаті багаторічної селекційної роботи встановлено, що для отримання великоягідних безнасінних сортів необхідно проводити схрещування насіннєвих і безнасінних сортів. При цьому як материнські форми використовують великоягідні насіннєві сорти, а як батьківські — безнасінні.
Однак безнасіннєва гібридизація пов'язана з низкою труднощів, основними з яких є:

Крім того, загальним слабким місцем методу гібридизації є те, що при вирішенні задачі створення нових форм гібридному організму переносяться небажані комбінації господарських ознак і біологічних властивостей, що обумовлено законом зчеплення генів. Стосовно селекції винограду на безнасінність це виражається в тому, що у гібридних нащадків безнасінність корелює з дрібністю ягід.
Завдяки досягненням біотехнології, насамперед у галузі культури тканин, і появі можливості культивування насіннєвих зародків in vitro, відкрилася перспектива отримання життєздатного потомства від схрещування безнасінних сортів між собою з подальшим розвитком насіннєвих зародків у контрольованих умовах.
Застосування методів in vitro для подолання постзиготичної аборгенції розширює можливості селекції на безнасінність і дозволяє включати стеноспермокарпічні сорти та гібриди в процес селекції як материнські форми. Ці сорти не є справді безнасінними, оскільки їх ягоди містять недорозвинені насіння різного розміру. У них відбувається запилення, але потім розвиток зародків припиняється, а насіння абортується. В даний час стеноспермокарпічні сорти складають 85% світового асортименту столового і кишмишного винограду.
Наявність насіння або життєздатних ембріонів у нормальному безнасінному фенотипі вказує на те, що безнасінні ембріони є генетично повноцінними. Їх недорозвинення може бути результатом фізіологічного дисбалансу батьківських тканин у критичний період онтогенезу. Створення сприятливих умов у цей період дозволяє запобігти загибелі та підтримати подальший розвиток ембріонів.
Одним із найперспективніших напрямів створення міжвидових і міжродових гібридів є ембріокультура. Цей метод також представляє інтерес при виведенні безнасінних сортів, оскільки дозволяє вирощувати гібридні зародки на ранніх стадіях розвитку, запобігаючи їх деградації, що призводить до утворення безнасінності. У літературі розглядаються два види ембріокультури: використання незрілих і зрілих ембріонів, а також вирощування семязачатков від вільного запилення і схрещування безнасінних сортів між собою.
Мета нашого дослідження, проведеного під керівництвом зав. лабораторії біотехнології, доктор сільськогосподарських наук Н.П. Дорошенка, було дослідження ембріогенного потенціалу стеноспермокарпічних сортів винограду та розробка методу отримання життєздатних пагонів і сіянців із ізольованих семязачатків у культурі in vitro.
Предметом дослідження були семязачатки від самозапилення 14 сортів і 30 комбінацій схрещування стеноспермокарпічних сортів з гібридними формами винограду V. vinifera та міжвидового походження різних категорій безнасінності.
Отримані результати свідчать про те, що використання методу культури ізольованих семязачатків дає можливість отримати саджанці від самозапилення стеноспермокарпічних сортів винограду. У цьому випадку врожайність розсади залежить від генотипу цих сортів. Кількість життєздатного насіння від інкубації сортів V.vinifera L. Белградський безнасінний, Таїровський рожевий (8-25-78), Віта, Перлет, Рожевий бісер і Кишмиш променистий становила 0-3,8%. Рівень ембріогенного потенціалу сортів міжвидового походження Русбол, Кишмиш Новочеркаський, Гібрид № 311 досягав 50-60%.
При використанні стеноспермокарпічних генотипів як батьківських форм встановлено достовірні відмінності між комбінаціями схрещувань за рівнем ембріогенного потенціалу. Його низькі значення відзначені при схрещуванні, де за материнську форму були взяті сорти V. vinifera L. (Кишмиш променистий х Русбол, Белград безнасінний х Русбол, Мечта х Русбол). Кількість яйцеклітин із життєздатними ембріонами в схрещуваннях [-15-5-7- х Русбол, 1-15-5-7 х унікальний Кишмиш, 1-15-7-1 х унікальний Кишмиш становила 11-18 %. Високі показники ембріогенезу (37-45%) відзначені при запиленні сорту Кишмиш ЦГЛ пилком унікальних сортів Кишмиш, Корінка Російська, Русбол.
Встановлено, що кількість отриманих сходів значною мірою залежить від терміну виділення та висіву семязачатків на живильне середовище. При цьому для різних сортів бажані різні терміни ізоляції.
Виявлено сильний нелінійний кореляційний зв’язок між періодом виділення семязачатка та виходом сходів (R2 = 0,89). Для підвищення врожайності життєздатних рослин виділення гібридних семязачатків і введення їх у культуру слід проводити через 65-100 днів після запилення (з урахуванням генотипу батьківських сортів).
Одним із критеріїв визначення оптимального терміну введення зачатків в культуру може бути співвідношення кількості нормальних зачатків і зачатків у ягоді. Виходячи з цього, зачатки сортів високої категорії безнасінності (Перлет) слід вводити в культуру в термін до 50 днів з моменту запилення, сорти III-IV класу безнасінності - до 80 днів після цвітіння, а зачатки сортів типу Русбол - протягом усього періоду дозрівання і повного дозрівання ягід.
Випробування поживних середовищ виявило перевагу середовища Уайта порівняно з середовищем Нітша для вирощування семязачатків стеноспермокарпічних сортів винограду (кількість розвинених зародків зросла з 11,1 до 36,5%).
При введенні семязачатків винограду в культуру in vitro встановлено високу ефективність використання нітрату срібла як стерилізатора. Подвійна стерилізація (ягід і виділених з них семязачатков) 0,8% розчином AgNOi протягом 5-10 хвилин дозволяє знизити кількість заражених семязачатков до 3,9-4,6% порівняно зі 100% зараженням при обробці 10% розчином гіпохлориту кальцію з експозицією 30 хвилин.
Встановлено, що значний вплив на розвиток ембріонів мають погодні умови під час формування генеративних органів, запліднення та післязапліднення (таблиця).
Таблиця
Коефіцієнт кореляції між ембріогенним потенціалом семязачатків і погодними факторами в різні періоди вегетації

Кореляційний аналіз показав, що найбільш тісний зв'язок існує між ембріогенним потенціалом семязачатків і кількістю тепла під час бутонізації (r = 0,69), а також запліднення та післязапліднення (r = 0,66).
Гібридний фонд поповнився новими формами. Виявлено безнасінні форми винограду: VI-15-1-2 (Кишмиш ЦГЛ х Коринка російська) III-IV класу безнасінних з масою ягоди 1,7 г, середньою масою насіння 17 мг та сіянець з родини Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш унікальний - маса ягоди 2,3 г, насіння - 30 мг.
Ембріокультура дає можливість вирощувати гібридні рослини з дефектних ембріонів. Проте врожайність гібридних рослин невисока. Тому перед дослідниками часто постає завдання розмножити і зберегти отримані рослини. У цьому допомагає метод клонального мікророзмноження. Розмножують гібриди шляхом активації розвитку меристеми пазушних бруньок (черешками безплідних пагонів), придаткових бруньок або регенерацією рослин з калюсної тканини.
Сіянці, отримані нами від схрещування обох безнасінних батьків, були вегетативно розмножені методом клонального мікророзмноження. Збільшення популяції цих форм підвищує ймовірність їх збереження та дає можливість для подальшого вивчення агробіологічних особливостей з метою отримання безнасінних гібридів високого класу з підвищеною стійкістю до несприятливих умов середовища.
На основі проведених досліджень розроблено методику отримання вихідного матеріалу для селекції безнасінних сортів із ізольованих семязачатків у культурі in vitro, що включає наступні етапи:

Література

За матеріалами конференції: Сучасні досягнення біотехнології у виноградарстві та інших галузях сільського господарства, Новочеркаськ, 29-30 червня 2005 р. / ГНУ ВНІІВіВ ім. Я.І. Потапенко.