Товарів: 0
На суму: 0 грн
Біологія культивованих клітин і біотехнологія рослин: Збірник статей за ред. Р.Г. Бутенко М.: Наука, 1991. 216-220 с.
УДК 581.143.6
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ ВИНОГРАДУ
А. Б. БУРГУТІН
Інститут фізіології рослин ім. К. А. Тімірязєва АН УРСР,
Москва
Мікроклональне розмноження включає масове нестатеве розмноження рослин в асептичних умовах, що дає змогу виключити появу генетично модифікованих форм [7]. Успішному розмноженню рослин in vitro на практиці передувала робота над технікою культивування ізольованої верхівки пагона. Морель одним із перших успішно культивував апікальні меристеми багатьох видів рослин (картоплі, жоржин, орхідей, соняшників, гвоздик) [11, 22]. Р. Г. Бутенко досліджував фізіологію ізольованих верхівкових бруньок перилли, фарбитису, рудбекії, стебла картоплі та сої [4]. Удосконалення винограду культурою верхівкової меристеми із застосуванням термотерапії було розпочато Галзі [19, 20] і не втратило своєї актуальності й донині [18]. В СРСР роботи з розмноження винограду in vitro ведуться з початку 1980-х років [1, 3, 5].
Для винограду показано три способи отримання мікропагонів.
Для ремонтного відбору (розплідного розведення), без загрози збільшення мінливості, можна рекомендувати перший із перерахованих шляхів [21], який ми використовуємо в своїй роботі [3], тим більше, що цей шлях є найбільш технологічно розробленим. Перевіряють генетичну стабільність матеріалу, отриманого другим методом [21, 24], оскільки багаторічна культура проліферуючих пагонів з індукцією цитокініном розвитку пазушних бруньок першого, другого та наступних порядків не виключає появи адвентивних пагонів (тобто формування пагонів de novo). Таким чином, оптимізм ранніх робіт з мікророзмноження полуниці з використанням цитокініну [13] був замінений (того ж автора) реальними оцінками – зі збільшенням кількості асептичних пересадок у полі реєструються мутанти та значне зниження врожайності ягід [14]. Також є пряма вказівка на підвищену мінливість винограду при такому способі розмноження [16]. Виявлення можливих генетичних порушень може бути відтерміновано в часі до генеративного періоду, що неприпустимо для плодів і винограду, оскільки виявлення відхилень від сортових ознак у багаторічних насадженнях знецінить виробничі насадження.
Ембріогенез як додатковий процес у винограду призводить до появи форм з відхиленнями від вихідних [6, 9]. Виходячи з вищесказаного, ембріогенез можна рекомендувати саме для отримання різноманітності, але не для цілей розсадництва такої важливої сільськогосподарської культури, як виноград, для якої генетична нестабільність, зумовлена, зокрема, анеуплоїдією, може спричинити зниження плодючості, не кажучи вже про зміни інших технологічних характеристик сорту.
Таким чином, мікрочеренки, мабуть, знайдуть найбільше застосування в практиці розсадництва винограду, хоча запропоновані й інші способи, засновані на культурі проліферуючих пагонів при високих концентраціях цитокінінів [6], хоча з останнім не можна погодитися.
Слід підкреслити, що повністю відмовитися від використання цитокініну для першого із запропонованих шляхів поки що неможливо, хоча це застосування обмежується лише одним (нульовим) пасажем – культивуванням ізольованої меристеми. При внесенні зразка в культуру in vitro у вигляді великого експланта (частини пагона, бруньки), коли немає мети загоєння, потреба у використанні цитокініну повністю відпадає [10, 15], якщо розмноження передбачається проводити мікрочеренками.
При розмноженні мікроживками слід враховувати особливості винограду як деревоподібної ліани - не всі живці проростають одночасно, як це буває у трав'янистих рослин (наприклад, картоплі). Якщо живець взято не з молодої частини, або з верхівкової частини пагона, то його розвиток (укорінення, пагоноутворення) відстає. Деякі живці взагалі не сходять. Останнє залежить від генотипу. Так, форми Подарок Магарача та Кобера 5ББ при мікрорізці дають до 100% сходів, а у сортів Ркацителі та Ананас – 70 та 60% відповідно.
При масштабуванні процесу важливим є осадження при низьких позитивних температурах [21]. Нами апробовано холодний спосіб зберігання для ряду генотипів (Дар Магарача, Білий кишмиш та ін.). Усі досліджувані сорти відновлювали через 8 місяців зберігання при температурі 12-15° у фітотронній камері Інституту каркасних наук АН УРСР.
У будь-якому випадку ефективність розмноження така, що дає можливість отримувати сотні тисяч пробіркових рослин на рік з одного вихідного.
Обсяг цього повідомлення не дозволяє детально зупинитися на всіх моментах, пов'язаних з культивуванням рослин in vitro. Загальні положення детально висвітлені як у закордонних [17, 25], так і у вітчизняних методичних рекомендаціях [4, 7]. Багато аспектів технології розмноження винограду in vitro представлено у вже згаданому посібнику [6]. Все ж вважаємо за потрібне зупинитися на деяких аспектах нашого особистого досвіду з виноградом.
З однаковим успіхом апробовані поживні середовища на основі рецептів неорганічних солей, які використовували ряд авторів [6, 8, 21, 24]. Порівнюючи їх в експерименті, ми зупинилися на вже використаній нами рецептурі [3] на основі неорганічних компонентів за Мурашигою та Скугом [23] із внесенням ІУК у концентрації 0,1–0,2 мг/л. При культивуванні апікальних меристем ауксин у цій рецептурі замінюють на цитокінін (БАП у концентрації 1 - 2 мг/л). Вважаємо, що при введенні в культуру in vitro перші субкультивації краще проводити в прозорих твердих середовищах (агар-агар) - так ефективніше контролювати контамінацію. Після отримання розвиненого пагона подальшу субкультивацію можна проводити в непрозорих (активоване вугілля, штучні смоли та інші наповнювачі: пісок, целюлоза та ін.) і за необхідності рідких середовищах.
Переведення рослин у ґрунтову культуру.Нами застосовані прийоми, які дозволяють значно спростити технологію переведення рослин у ґрунтову культуру [2]. Відповідно до існуючої технології, рослини in vitro проходять адаптацію до умов кліматичної камери або оранжереї після вилучення їх із пробірок (колб). Для винограду такий підхід не дозволяє відмовитися від створення вологої камери в перший період адаптації, як це можливо, наприклад, для картоплі [12]. Ніжні тканини листків пробірного винограду в’януть і некротизуються без вологої камери (варіант: дрібнокрапельне обприскування).
Ми застосували інший підхід до подолання існуючих труднощів. У пробірках рослини безболісно адаптуються до умов кліматичної камери чи теплиці – для цього достатньо зняти пробки з тих пробірок, у яких до пробки дійшов відросток. У такому стані рослини залишають на 1,5 – 2 тижні. Щоб запобігти утворенню цвілі на агаризованому середовищі, досить за цей період 3-4 рази полити рослини водопровідною водою - зволожити поверхню агару і злити надлишок води, перевернувши пробірку. Після закінчення зазначеного терміну верхівка рослини і один-два розвинених листка будуть за межами пробірки. Ця рослина готова до пересадки в грунт. Пересаджувати рослину слід на агаризоване середовище – так менше пошкоджується коренева система. Заглиблювати втечу в грунтовий субстрат потрібно так, щоб верхівка з одним-двома розвиненими листками залишалася над поверхнею. Не потрібні туманоутворювач або волога камера. Для захисту рослини від хвороботворних мікроорганізмів слід використовувати стерильний грунтовий субстрат або річковий пісок, вільний від нематод, а також ізолювати приміщення від комах-переносників.
За цією технологією неодноразово випробувані форми: Магарач 124-66-14, Ркацителі, Кішмиш білий (Хісраві), Тайфі рожева, Кобера 5ББ, Мускат бурштиновий, Перлина кримська. Останні два різновиди подарував нам А.І. Шелякін (відділ виноградарства Республіканської сільськогосподарської дослідної станції ЧАРСР, м. Грозний). З понад 200 пересаджених таким чином рослин не було жодної невдачі. Рослини сорту Ркацителі, висаджені з пробірок в 1988 році, дали урожай ягід в 1989 році в тепличних умовах Інституту каркасних наук АН СРСР.
ЛІТЕРАТУРА