Товарів: 0
На суму: 0 грн
УДК
Волинкін Володимир Олександрович,д.с.-г.н., проф., гол. n.s. відділ селекції, генетики винограду та ампелографії, [email protected];
Ліховський Володимир Володимирович,кандидат сільськогосподарських наук, завідувач кафедри селекції, генетики винограду та ампелографії, [email protected];
Олейніков Микола Петрович, кандидат сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник, провідний науковий співробітник відділу селекції, генетики винограду та ампелографії, [email protected];
Павлова Ірина Олександрівна, к.б.н., старший науковий співробітник, в.о. завідувача сектором клонової селекції та розмноження винограду, [email protected];
Левченко Світлана Валентинівна, к.с.-г.н., старший науковий співробітник відділу селекції, генетики винограду та ампелографії, [email protected];
Зленко Валерій Анатолійович,кандидат сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник відділу селекції, генетики винограду та ампелографії, [email protected]
Василик Ірина Олександрівна,Кандидат сільськогосподарських наук, науковий співробітник Відділ селекції, генетики винограду та ампелографії, [email protected]
Національний інститут винограду і вина «Магарач», м. Ялта, вул. Кірова, 31. [email protected]
Шелудько Юрій Всеволодович, к.т.н., зав.лаб. системи біосинтезу природних сполук, кафедра генетичної інженерії, [email protected]
Герасименко Ірина Михайлівна, к.т.н., науковий співробітник лаб. систем біосинтезу природних сполук, кафедра генетичної інженерії, [email protected]
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Україна, м. Київ, вул. Заболотного 148, [email protected]
Класичні та інноваційні підходи в галузі клітинної біології та генної інженерії для покращення характеристик сортів винограду
Анотація: Постійні зміни стану біосфери зумовлюють необхідність постійного сортооновлення, а створення сортів, що відповідають цим умовам, не завжди можливо традиційним методом генеративної гібридизації. Розглянуто шляхи та способи формування нового генотипу винограду біотехнологічними методами з використанням класичних та інноваційних підходів у галузі клітинної біології та генної інженерії та обговорено попередні результати досліджень.
Ключові слова: генетично модифіковані рослини, вірусні захворювання, бактеріальні раки винограду, трансгенні лінії, капсидний білок, сомаклональна мінливість.
Волинкін Володимир Олександрович, д-р с.-г. наук, професор, завідувач кафедри рослинництва, генетики винограду та ампелографії.
Ліховський Володимир Володимирович, канд. Agric. наук, завідувач відділу селекції, генетики винограду та ампелографії.
Олейніков Микола Петрович, канд. Agric. наук, старший науковий співробітник, провідний науковий співробітник відділу селекції, генетики винограду та ампелографії.
Павлова Ірина Олександрівна, канд. Biol. наук, старший науковий співробітник, в.о. завідувача сектору клонової селекції
Левченко Світлана Валентинівна, агр. наук, старший науковий співробітник, старший науковий співробітник відділу селекції, генетики винограду та ампелографії.
Василик Ірина Олександрівна, канд. Agric. наук, науковий співробітник відділу селекції, генетики винограду та ампелографії.
Національний інститут винограду і вина Магарач, АР Крим, м. Ялта, вул. Кірова, 31,
Шелудько Юрій Всеволодович, канд. Biol. наук, завідувач лабораторії систем біосинтезу природних продуктів кафедри генетичної інженерії, [email protected]
Герасименко Ірина Михайлівна, канд. Biol. Sci Sci. Науковий співробітник лабораторії систем біосинтезу природних продуктів кафедри генетичної інженерії, [email protected]
Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Україна, Київ, вул. Заболотного, 148, [email protected]
Класичні та інноваційні підходи в клітинній біології та генній інженерії для покращення характеристик сортів виноградної лози
Abstract: Сучасні глобальні зміни біосфери породжують необхідність постійного оновлення сортів садових рослин. Застосування традиційних підходів генеративної гібридизації не завжди гарантує створення нових сортів, що задовольняють новим вимогам. Тут ми розглядаємо шляхи та підходи до формування нових генотипів виноградної лози з використанням класичних та інноваційних протоколів клітинної біології та генної інженерії; обговорюються попередні результати досліджень.
Ключові слова: генетично модифіковані рослини, вірусна хвороба, галична хвороба виноградної лози, трансгенні рослини, капсидний білок, сомаклональний сорт.
Використання сучасних біотехнологічних підходів для забезпечення стійкості цінних сільськогосподарських рослин до патогенів є одним із найактуальніших завдань біології на даний момент, вирішення якого може сприяти забезпеченню продовольчої безпеки світу в умовах зміни клімату, що розвивається, а також зменшити навантаження на екосистеми, спричинене широкомасштабним використанням пестицидів. Вивчення молекулярно-біохімічних механізмів такої резистентності створює інформаційну базу, яка дає змогу отримувати рослинні організми з мінімальними необхідними змінами та збереженням усіх цінних характеристик, що, у свою чергу, забезпечує економічну вигоду для фермерів та агрокомпаній. Застосування генетично модифікованих рослин, стійких до хвороб і шкідників, за 10 років зменшило потребу в обробці пестицидами в 3-6 разів, а на прикладі бавовнику за три роки забезпечило збільшення прибутків фермерів різних країн на 12-340%. За даними ФАО за 2001 р. використання сої, стійкої до гербіциду Раундап, призвело до збільшення загального прибутку на 53% за рахунок зниження собівартості продукції [1]. Таким чином, економічна вигода від розробки ліній рослин, стійких до патогенів, може становити близько 10-20% у перші 5 років використання.
Виноград є однією з основних сільськогосподарських культур Кримського півострова, що забезпечує близько половини харчової промисловості Криму. У зв’язку з цим надзвичайно актуальним є питання зменшення втрат урожаю виноградників внаслідок впливу патогенів, часто пов’язаних із сезонними кліматичними умовами. Наприклад, поширений у Криму вірус золотистого пожовтіння винограду (у випадку епіфітотій) може призвести до втрати 20-30% урожаю. Вірусне захворювання, викликане вірусом віялового листя винограду (GFLV), за даними Fuchs M. and Gonsalves D. (2007), вражає до 60% посадок винограду у Франції та завдає збитків приблизно на 1 мільярд доларів США щорічно [2]. Боротьба з цими захворюваннями спрямована на знищення переносників і збудників хвороб і вимагає регулярного широкомасштабного застосування інсектицидів і фунгіцидів, а також профілактичної обробки ґрунтів і розсади.
Ще одним небезпечним захворюванням є рак винограду, викликанийAgrobacterium vitis. Хвороба була зареєстрована в багатьох регіонах, включаючи Китай, Японію, Південну Африку, Європу, Російську Федерацію та Америку [3], і вважається найважливішою бактеріальною хворобою винограду [4]. Рак винограду викликається ґрунтовою бактерієюAgrobacterium vitis, здатний переносити частину свого генетичного матеріалу в рослинні клітини та інтегрувати його в геном. В результаті експресії бактеріальних генів змінюється гормональний баланс рослинних клітин, відбувається неконтрольований ріст пухлиноподібної тканини, що в кінцевому підсумку призводить до некрозу і пригнічення росту і плодоношення. Пухлина часто розвивається в області щеплення і може бути викликана морозом або механічними пошкодженнями. При інтенсивному розвитку хвороба на четвертий рік призводить до зниження врожайності ягід і темпів росту лози на 40 % порівняно з неушкодженими рослинами [5].
Детальні біохімічні та генетичні дослідження проведені сAgrobacterum vitis, показали, що продукти двох генів, які беруть участь у біосинтезі ауксину (iaaH, iaaM), і гена, який бере участь у біосинтезі цитокініну (ipt), відповідають за утворення пухлини. Також виділено ген, відповідальний за некроз тканин (pehA) [6].
Вірусні інфекції та бактеріальні раки мають спільну рису, яка дозволяє використовувати однакові підходи для створення ліній рослин, стійких до цих захворювань. В обох випадках генетичний матеріал патогенів проникає в клітину і експресується за участю внутрішньоклітинних ферментативних комплексів. Порушення ланцюга передачі інформації ДНК (РНК)-мРНК-білок заблокує розвиток інфекції та забезпечить організму стійкість до цих збудників.
Одним із найефективніших доступних на даний момент методів блокування вірусних інфекцій у рослин є індукування мовчання вірусних генів за допомогою власних систем захисту рослин. Найбільш успішною стратегією отримання трансгенних рослин, стійких до вірусів, є стійкість, отримана від патогенів. Метод заснований на перенесенні фрагментів геному вірусу в геном рослини. Найбільш часто використовуваними генами є гени капсидного білка, а також гени репліказ, протеїназ і транспортних білків. Хоча механізми, що призводять до розвитку резистентності вірусу внаслідок перенесення вірусних генів у рослини, до кінця не відомі, припускають, що в більшості випадків опосередкована патогенами резистентність розвивається за участю РНК-опосередкованої інтерференції [7].
Центральну роль у запуску РНК-опосередкованої інтерференції відіграють короткі молекули РНК (мікроРНК або короткі інтерферуючі РНК), які утворюються з дволанцюгових попередників РНК. Основою для синтезу коротких РНК можуть бути як дволанцюгові РНК-геноми вірусів, так і одноланцюгові РНК, кодовані геномом рослин і здатні утворювати частково дволанцюгові шпилькові структури. Також другий ланцюг можна додати до одноланцюгової вірусної геномної РНК і чужорідних транскриптів за допомогою РНК-залежних РНК-полімераз рослин [8]. Отримані короткі РНК зв’язуються з білковими комплексами, які можуть пригнічувати експресію генів на різних рівнях і служать адаптерами, які направляють інактивуючі комплекси на комплементарні послідовності нуклеїнових кислот. У результаті спостерігається мовчання відповідних генів на посттранскрипційному рівні (пригнічення трансляції або деструкція РНК) або інгібування транскрипції [9].
Перше покоління трансгенних рослин, що демонструють опосередковану патогенами стійкість до вірусу, було отримано шляхом перенесення трансляційно-компетентних вірусних генів. В даний час деякі з цих різновидів доступні на ринку. Сорт гарбуза CZW-3 (Asgrow Seed Co.), який експресує гени капсидних білків вірусів жовтої мозаїки цукіні, кавуна та огірка, демонструє стійкість до цих трьох вірусів і дозволений до використання в США та Канаді [10]. Найбільшого комерційного успіху досягли сорти папайї, стійкі до вірусу кільцевої плямистості завдяки експресії гена капсидного білка цього вірусу. Використання стійких сортів Rainbow і SunUp сприяло відновленню виробництва папайї на Гаваях у 1990-х роках після того, як поширення вірусу кільцевої плямистості папайї привело галузь до межі банкрутства. Недоліком використання нативних вірусних генів є значна гетерогенність трансгенних ліній за рівнем резистентності. Ймовірно, це пов'язано з необхідністю участі рослинних РНК-залежних РНК-полімераз в утворенні дволанцюгових коротких РНК-попередників. Згодом підхід було вдосконалено шляхом введення в геном рослини послідовностей, що кодують нетрансльовані молекули РНК, які мають структуру шпильки і безпосередньо служать субстратом для синтезу siRNA [11]. Такі послідовності можуть бути розташовані в інтронах генів, що кодують білки [12]. Цим методом отримано трансгенні рослини багатьох видів, стійкі до різних вірусів [13].
Короткі РНК також можна використовувати для створення рослин, стійких до патогенів інших систематичних груп. Експресія в рослинах шпилькової РНК, гомологічної гену білка, що секретується нематодою, призвела до значного підвищення стійкості [14]. Були зроблені спроби синтезу siRNA в рослинах, спрямованих проти генів фітопатогенних грибів. Хоча було показано, що це знижує рівні транскрипції відповідних грибкових генів, істотного підвищення стійкості рослин не спостерігалося [15].
Перенесення Т-ДНК в рослинну клітинуAgrobacterium tumefaciensтакож призводить до утворення коротких інтерферуючих РНК [16], що підтверджує роль РНК-опосередкованого сайленсингу генів у розвитку стійкості до захворювань Agrobacterium. Показано, що попередня обробка рослин винограду непатогенними штамами агробактерій призводить до розвитку стійкості до подальшого зараження патогенними штамами [3]. Можливо, в основі цього явища лежить мовчання генів фітопатогенного штаму, викликане короткими РНК, синтезованими на основі транскриптів непатогенних штамів. Придушення експресії різних генівA. запаленняу трансгенних рослинах винограду дозволить з’ясувати їх роль у розвитку пухлин. Нещодавня публікація демонструє можливість використання РНК-опосередкованого глушіння генів у розвитку стійкості винограду доАгробактерія[17]. Після трансформації винограду з послідовностями, які індукують мовчання генів і гомологічних ділянок онкогенівiaaМ іiptПлазміди pTiA6 були використані для отримання ліній рослин, резистентність яких до цього штаму бактерій корелювала з рівнем експресії трансгену, хоча автори відзначають відсутність стійкості до інших штамів.
Використання цілеспрямованого введення в клітини рослин окремих генів, відповідальних за стійкість до несприятливих факторів і патогенів, дасть змогу, з одного боку, вивчити фізіологічні та біохімічні особливості гетерологічної експресії трансгенів, а з іншого – створити лінії винограду класичних сортів із покращеними властивостями, що зберігають усі ознаки сорту та несуть нові господарсько-цінні ознаки. Цей метод виключає необхідність віддаленої гібридизації та подальших етапів зворотного схрещування, які пов'язані з ризиком втрати або зміни сортових ознак і займають тривалий час. Зараз розробка та польове випробування генетично модифікованих ліній винограду активно ведеться в країнах з розвиненим виноградарством, таких як США, Австралія, Італія, Канада, Німеччина та Чилі [18]. Польові випробування в Чилійському інституті сільськогосподарських досліджень (Сантьяго) включають тестування близько 700 трансгенних ліній винограду.
Ключовим моментом для проведення генетичної трансформації винограду є отримання ембріогенної клітинної лінії та розробка протоколу регенерації повноцінних рослин. Незважаючи на те, що перші успішні протоколи соматичного ембріогенезу винограду були опубліковані ще в середині 70-х років минулого століття [19, 20], отримання стабільної ембріогенної культури клітин залишається складним завданням, що вимагає індивідуального підходу до кожного сорту, а також внутрішньосортових варіантів [21]. Проте в результаті експериментального підбору концентрацій фітогормонів, вітамінів і мінералів у живильному середовищі можна отримати оптимальне поєднання, яке забезпечує ефективний ембріогенез і подальшу регенерацію рослин. Важливим аспектом при цьому є вибір вихідної ембріогенної тканини, якою найчастіше використовуються пильовики різного ступеня дозрівання, суцвіття, листкові експланти, міжвузля та деякі інші види тканин. Отримані культури можуть бути використані як джерела для регенерації генетично модифікованих рослин, селекційної роботи з використанням спонтанної або індукованої сомаклональної мінливості [22], а також виробництва безвірусних рослин [23] або гіпокотильних експлантів, які використовуються як підщепи [24]. Слід зазначити, що поєднання трансгенної підщепи та нетрансгенної прищепи в деяких випадках дозволяло контролювати поширення хвороби у всій рослині, як описано для експресії антимікробних білків, які забезпечують стійкість до хвороби Пірса та поширюються по ксилемі [25]. Елітна прищепа в цьому випадку зберігає свою генетичну унікальність і не несе чужорідних генів. У ряді країн розглядається можливість використання таких щеплень у сільському господарстві за спрощеною процедурою, порівняно з генетично модифікованими рослинами.
Таким чином, сучасна біотехнологія пропонує набір класичних та інноваційних підходів у галузі клітинної біології, молекулярного клонування та генної інженерії, реалізація яких дозволить отримати унікальну інформацію в області фізіології взаємодії рослин і патогенів, забезпечуючи системну резистентність до патогену при збереженні генетичної ідентичності нащаду, а також створюючи колекцію культур ембріогенних клітин і трансгенних ліній рослин, стійких до вірусних і бактеріальні захворювання, перспективні Кримські сорти винограду.
