Підвищення регенеративних здібностей експлантів при клональному мікророзмноженні винограду

Т.М. Череватая
ННЦ «Інститут виноградарства і виноробства ім. В.Є.Таїрова» УААН, Одеса
Наведено результати досліджень щодо оптимізації процесу клонового мікророзмноження для виробництва садивного матеріалу винограду. Підвищення економічної ефективності технології досягається використанням розробленої методики попередньої підготовки та відбору вихідного матеріалу, оптимального типу експлантів, оптимізованого складу поживних середовищ та іонообмінних субстратів, джерел світла з найбільш сприятливими спектральними характеристиками. Дослідження інтенсивності розмноження клонів винограду in vitro виявило кореляцію з продуктивністю клонів in vivo.
На сучасному етапі особливо гостро стоїть завдання отримання високоякісного садивного матеріалу для високопродуктивних сортів і клонів винограду. Спрямоване сортоудосконалення, селекція, вивчення перспективних клонів та їх розмноження є вагомим внеском у виробництво сертифікованого садивного матеріалу. Методи культивування in vitro забезпечують прискорене розмноження клонів винограду, одужали від вірусних і бактеріальних інфекцій, і отримання базового матеріалу, який є основою для виробництва сертифікованого садивного матеріалу. Таким чином, значно скорочується процес впровадження у виробництво нових сортів і клонів.
Лабораторія культури in vitro IV&V ім. В.Є. Таїрова діє у складі Центру клонової селекції. Відділ селекції клопів проводить велику роботу з виявлення перспективних клонів, їх вивчення та інтродукції. Основним напрямком науково-дослідної та науково-практичної діяльності лабораторії культури in vitro є вивчення особливостей розмноження in vitro сортів і клонів винограду та розробка біотехнології клонального мікророзмноження винограду. У нашій роботі успішно використовуються відомі методи мікроклонування [1,2]. Але для промислового прискореного розмноження та отримання якісного садивного матеріалу необхідно розробити високоефективну технологію з урахуванням особливостей клонового розмноження.
З цією метою проведено дослідження щодо оптимізації етапів клонового мікророзмноження, що дасть змогу створити інтегровану технологію цілорічного розмноження та отримання високоякісного садивного матеріалу винограду в необхідних обсягах. Розроблено методи підвищення регенеративних здібностей експлантів на кожному етапі розмноження in vitro, що в цілому прискорює процес мікроклонування та сприяє збільшенню обсягів виробництва.
Встановлено, що оптимальним видом вихідного матеріалу для клонового мікророзмноження винограду є зелені пагони кущів, вирощених у теплиці. Санітарному контролю підлягає стан маточників у тепличних ящиках. Вірусологічна лабораторія забезпечує візуальний огляд, а також лабораторне тестування на латентні патогени та надає здоровий матеріал для розмноження in vitro.
Розроблено спеціальну методику обрізки пагонів, яка стимулює активний ріст пасинків, що дає можливість мати вихідні експланти доступними для введення в стерильну культуру протягом тривалого вегетаційного періоду. Поєднання цього методу з прийомом вигонки пагонів з визрілої лози взимку забезпечує цілорічну доступність вихідного матеріалу для введення в безплідну культуру. Виявлено відмінності у розвитку початкових експлантів in vitro залежно від їх розміру та розташування на вихідному пагоні.
Оптимальним типом експлантів для клонового мікророзмноження винограду, що має високий морфогенетичний потенціал, є одновічкові мікрочерешки розміром 0,8-1,0 см, відібрані на рівні 3-4-го вузла вихідного пагона. Застосування даного типу експлантів дає змогу підвищити приживлюваність вихідних експлантів на 18-20% і скоротити час розвитку рослин на 2,0-2,3 доби на етапі введення в культуру. Особливості походження вихідного матеріалу дозволяють використовувати щадні методи стерилізації. Ступінчаста стерилізація з обробкою 60° етанолом (20 с) і використанням 2% розчину гіпохлориту кальцію як стерилізатора (5 хв) знижує рівень контамінації до 5-6% з високою виживаністю 85-90%.
Оптимізовано якісний та кількісний склад живильного середовища для перших етапів культивування in vitro. Встановлено можливість виключення синтетичних фітогормонів із зовнішнього середовища як можливої ​​причини хромосомних порушень. В результаті досліджень доведено ефективність введення в середовище додаткових джерел азоту - Ca (NO3)2 і суміші амінокислот для посилення росту і розвитку експлантів. Це дозволило прискорити утворення дорослих мікроклонів на 2,3-2,5 доби в кожному пасажі. Розвиток мікроклонів усіх дослідних сортів винограду на цьому живильному середовищі відбувається без прояву сортової специфічності. Процеси проліферації та ризогенезу експлантів відбуваються кон'югатно, що виключає додаткові пересадки на середовища іншого складу.
Досліджено вплив спектрального складу світла на процеси росту і розвитку винограду. Виявлено залежність особливостей розвитку мікроклонів від співвідношення червоного та синього світла в спектрі випромінювання фітоламп. Встановлено, що переважання червоного світла (625 нм) до 87,5 % значно активізує розвиток рослин на всіх етапах культивування in vitro та in vivo. Збільшення кількості синього світла до 25% покращує коренеутворення експлантів при культивуванні на агаризованих середовищах і сприяє скороченню періоду ризогенезу на 1,9-2,2 доби.
На етапах мікророзмноження in vitro, адаптації мікроклонів та культивування в теплиці доведено доцільність використання іонообмінних субстратів. Для клонального мікророзмноження винограду in vitro розроблено штучний багаторазовий іонообмінний живильний субстрат Біон. В результаті проведених досліджень визначено його оптимальні фізико-хімічні властивості. Найбільш інтенсивний розвиток рослин забезпечує тип субстрату з рН < 6 і аніонітообмінною ємністю Е = 4,5 мг - екв/г. Застосування цього субстрату підвищує економічну ефективність технології за рахунок зниження витрат хімічних реактивів, трудовитрат, скорочення часу культивування.
Також на етапі адаптації проводились дослідження щодо визначення оптимального типу субстрату для культивування мікроклонів. Як субстрат для адаптації та росту мікроклонів використовували мінеральний субстрат на основі цеоліту. Субстрати мають подібні фізико-хімічні та структурні властивості та забезпечують оптимальний тип живлення мікроклонів шляхом іонного обміну [3]. Безперервність іонообмінних субстратів при перенесенні мікроклонів з умов in vitro в умови in vivo сприяє швидкій і успішній адаптації кореневої системи до нових умов і підвищує виживаність рослин.
Адаптацію проводили шляхом поступової підготовки кореневої системи та надземної частини рослин до умов in vivo. Для цього мікрочіпи висаджували на суміш іонітних підкладок Bion: цеоліт у співвідношенні 1:1; 1:2; 3 : 1. У ємності d = 5 см, h = 10 см насипали субстрат об’ємом 45-50 см3. Після посадки мікрочерешок контейнери закривали кришками з фольги і поміщали в культуральний ящик. Після появи другого листка на пагоні почалася поступова адаптація. Для цього кришки злегка відкривали на 8-10 днів спочатку на 1/3 поверхні, потім на 1/2, 2/3, після чого тару відкривали повністю. Далі рослини переносили у ящик для вирощування з температурою 21-22 °С, вологістю 55-60%, освітленістю 3,0-3,5 тис. лк і короткочасно культивували перед висадкою в теплицю. За цей період, завдяки оптимальним розмірам контейнерів і спеціальному типу субстрату, рослини сформували більш потужні, потовщені пагони і кореневу систему; рослинні тканини набули здатності утримувати воду завдяки розвитку воскоподібного епікутикулярного епідермісу та активації продихового апарату. Результати експерименту показали, що найбільш сприятливим для розвитку рослин є співвідношення субстрату 3:1 (фракція цеоліту – 2,0-3,0 мм). Приживлюваність експлантів на цьому субстраті на 32-35% вище в порівнянні з іншими варіантами; ризогенез і проліферація починаються на 1,8-2,0 доби раніше (табл. 1). Через 10-14 днів рослини висаджували на постійне місце для дорощування в тепличні секції в гряди з цеолітовим субстратом (фракція 5-7 мм) за схемою посадки 15 х 15 см. При цьому коренева система зазнала мінімальних пошкоджень. Виживаність становила 97-98%. До них застосовували комплекс агротехнічних заходів, прийнятих у тепличному комплексі Центру клонової селекції.

Таблиця 1
Вплив типу живильного субстрату на розвиток мікроклонів на етапі адаптації (сорт Каберне Совіньйон, середнє за 2002-2004 рр.)

Співвідношення Віон:цеоліт	Фракція цеоліту, мм	виживаність, %	Кількість коренів, шт.	Довжина кореня, см	Висота рослини через 30 днів
1 : 1	0,5-1,0	27.2	2.0	1.5	2.8
	2,0-3,0	34.6	2.7	1.9	4.2
	4,0-5,0	38.1	2.4	1.7	4.0
1:2	0,5-1,0	31.4	2.3	1.8	3.9
	2,0-3,0	42,0	2.8	2.2	4.8
	4,0-5,0	67.3	2.5	2.0	4.5
3 : 1	0,5-1,0	49.4	3.7	3.5	4.6
	2,0-3,0	93.8	4.3	4.4	6.7
	4,0-5,0	75.2	4.0	3.9	5.8
Контроль: цеоліт	3,0-5,0	23.5	2.9	1.4	4.1
NSR05		4.38	0,7	0,63	0,52

Таким чином, адаптацію рослин здійснювали шляхом поєднання процесів укорінення мікроживців, вирощування мікроклонів з початковою стадією адаптації. Використання даної методики та встановлення оптимального типу субстрату на етапі адаптації сприяє підвищенню життєздатності мікроклонів, тобто підвищує ефективність даної технологічної ланки.
Вивчення особливостей розмноження in vitro клонів винограду проводили за такими показниками: інтенсивність розмноження та здатність тканин мікроклонів дослідних клонів реалізовувати морфогенетичний потенціал in vitro. Отримані експериментальні дані свідчать про відмінності в інтенсивності розмноження in vitro як між сортами, так і між клонами в межах сорту. Серед дослідних клонів найвищий коефіцієнт розмноження (понад 6 місяців) виявив клон 441. Менш інтенсивним є розмноження клонів сортів Мускат Перлина та Шардоне, а найвищим коефіцієнтом відтворення є клони 7251 та 4876. Загалом клони прищепних сортів розмножуються інтенсивніше, ніж клони прищепні сорти. Найвищий коефіцієнт розмноження у клонів Berlandieri x Riparia C04 - 1791, Berlandieri x Riparia Cobera 5 BB - 211161 та Riparia x Rupestris 101 -14 - 672 (табл. 2).

Таблиця 2
Інтенсивність відтворення in vitro клонів винограду (2004 р.)

Різноманітність	Клон	Швидкість розмноження
Мускатна перлина	8153	1.7- 103
	8023	1,8- 10'
	7251	2,0- 103
Шардоне	4536	1.3- 103
	39303	1.4- 103
	4876	1.6- 103
Каберне Совіньон	30251	2.1- 10 Дж
	22103	2,3-10 Дж
	441	2,7- 10'
Рх Р 101-14	6114	1.9- 103
	672	2.1- 103
	4923	1.9- 103
B x R C04	2696	2.1- 103
	27101	2.6- 103
	1791 рік	2.7- 103
BxR Kobera 5 BB	205131	2,0- 103
	21192	2.3- 103
	211161	2,5-103

Вивчення інтенсивності калусогенезу та ембріогенезу тканин підщепних сортів винограду виявило відмінності між клонами в межах сорту (табл. 3). У сорту П х П 101-14 найвищий ембріогенний потенціал виявив клон 4923. Маса калюсних тканин і кількість морфогенних зон значно перевищують ці показники в клонах 672 і 6114. Серед дослідних клонів сорту ВхР Кобера 5 ББ найбільш продуктивним є клон 211161, а у сорту ВхП. C04 - 1791 і 27101.
Таблиця 3 -
Продуктивність клонів підщепних сортів винограду в культурі in vitro та в польових умовах (2004 р.)

Різноманітність	Клон	Швидкість розмноження	Вага мозолі, г	Кількість ембріогенних зон, шт./см2	Вихід живців з куща, шт.
Рх Р 101 - 14	6114	1,9- 10-	1,674	0,74	14.0
	672	2.1- 103	1,898	2.18	14.7
	4923	1.9- 103	2,183	2,97	19.1
Bx R Кобера 5ББ	205131	2,0- 103	1,952	0,93	37.6
	21192	2.3- 103	2,063	2.31	49.2
	211161	2,5-103	2,875	3.08	49.6
B x R C04	2696	2.1- 103	1,987	1.58	40.8
	27101	2.6- 103	2,968	3.02	39.2
	1791 рік	2.7- 103	2,982	3.24	42.8

Порівняльне дослідження продуктивності клонів in vitro та in vivo дало змогу встановити кореляційний зв’язок між досліджуваними показниками. Дослідження продовжуватимуть розробляти метод раннього прогнозування продуктивності клонів in vitro, що здається важливим для скорочення часу, необхідного для клонального відбору.
Оптимізація процесу клонового мікророзмноження винограду дозволила значно покращити показники розвитку рослин на всіх етапах вирощування. Розроблено високоефективну технологічну схему прискореного розмноження та вирощування садивного матеріалу винограду in vitro. Він заснований на застосуванні змінних іонообмінних поживних субстратів у поєднанні з оптимальними фізичними параметрами культивування з урахуванням особливостей розмноження клонів. Отримані результати свідчать про перспективність використання методу in vitro для цілорічного виробництва садивного матеріалу винограду.

Література

Методичні рекомендації з клонового мікророзмноження винограду / П.Я. Голодрига, В.А. Зленко, Л.А. Чекмарьов та ін. – Ялта, 1986. – 56 с.

Литвак А.І. Розмноження винограду в культурі in vitro // Виноградарство і виноробство УРСР. – 1982. – № 2. – С. 76-82.

Самсонов А.М., Стицько С.А. Виробництво сертифікованого садивного матеріалу винограду на іонообмінних субстратах // Виноградарство і виноробство. – К. : Аграрна наука, 1997. – С. 20-24.

За матеріалами конференції: Сучасні досягнення біотехнології у виноградарстві та інших галузях сільського господарства, Новочеркаськ, 29-30 червня 2005 р. / ГНУ ВНІІВіВ ім. Я.І. Потапенко.