Товарів: 0
На суму: 0 грн
А.А. Соболєва ГНУ ВНІІВіВ ім. Я.І. Потапенка Російської сільськогосподарської академії
З метою оптимізації технології клонального мікророзмноження винограду розроблені методики світлової біотехнології, що дозволяють знизити енергоємність процесу. У ході досліджень визначено оптимальні параметри інтенсивності та тривалості освітлення на різних етапах культивування, а також встановлено можливість спільного впливу на морфогенез фізичних і фізико-хімічних факторів у гранично малих дозах.
Найбільш надійним і перспективним методом лікування рослин від інфекцій хронічного та системного характеру є метод виділення апікальних меристем, регенерації з них рослин і подальшого їх клонального мікророзмноження в умовах стерильних культур. У нашій країні накопичено значний досвід мікророзмноження важливих для сільського господарства видів рослин. На думку JI.A. Лутова [1] національна біотехнологічна програма включає понад 30 видів сільськогосподарських культур, які задовольнять потреби країни в здоровому і цінному садивному матеріалі, вихідному матеріалі в селекційно-генетичних програмах для створення нових високопродуктивних сортів і, можливо, садивному матеріалі для експорту в інші країни.
З метою стабілізації і сталого розвитку виноградарсько-виноробної галузі РФ, переведення бази розсадництва на безвірусну основу і міжнародну систему сертифікації така робота проводиться в лабораторії біотехнології ВНІІВіВ ім. Я.І. Потапенка Російської сільськогосподарської академії.
Однак використання цього прогресивного методу оздоровлення та вирощування рослин значно відстає від реальних потреб галузі. Найбільш вагомою причиною, що гальмує його поширення, є відсутність масового виробництва. Перш за все це явище можна пояснити низьким рівнем матеріально-технічної бази, яка застаріла як морально, так і фізично. Але при цьому потребує оптимізації сама технологія вирощування. Водночас одним із найменш вивчених аспектів, а отже й одним із найбільш вразливих місць цього процесу, залишається вплив освітлення на морфогенез винограду in vitro. У зв’язку з цим ми розробляємо методи світлової біотехнології, яка полягає в опроміненні вегетативних і генеративних органів рослин імпульсним світлом [2], що дає змогу підвищити ефективність процесу оздоровлення та клонального мікророзмноження винограду.
Слід зазначити, що недоліком цього способу є висока вартість одержуваного основного посадкового матеріалу. Тому ми також вивчали можливість зниження енергоємності виробництва за рахунок зниження рівня споживаної електроенергії, що використовується для освітлення експлантів і регенерованих рослин. Основою для проведення досліджень у цьому напрямі став також загальновідомий факт, що за низького рівня освітленості рослини in vivo виявляють високу адаптивну здатність, яка полягає у зменшенні витрат асимілятів на дихання, збільшенні площі листя та інтенсивності фотосинтезу. Оскільки ізольовані тканини зазвичай вирощують з урахуванням вимог материнської рослини до умов освітлення, це судження також може мати значення для культур, які вирощуються in vitro.
Вплив світла на рослини залежить від трьох очевидних факторів, які необхідно враховувати в усіх дослідженнях із застосуванням випромінювання - інтенсивності, тривалості та якості освітлення.
Коли ми говоримо про інтенсивність освітлення, ми маємо на увазі, що це найбільш відповідна назва для опромінення. У фотобіології цей термін означає кількість променистої енергії, що падає на об’єкт, оскільки освітлення та яскравість не мають сенсу, оскільки світло не сприймається людським оком. У цьому випадку освітленість зазвичай вимірюється падаючим світлом, оскільки відображення змінюється неоднорідною поверхнею і поглинанням променів з певною довжиною хвилі. Особливо це актуально, коли світло падає на рослини зверху. Однак найчастіше опромінення виражають через інтенсивність освітлення [3].
Аналіз літературних джерел показав, що інтенсивність променевої енергії в процесі регенерації винограду in vitro коливається від 2000 до 7000 лк, а на етапі адаптації до нестерильних умов має бути не менше 8000 лк. У цьому випадку найбільш сприятлива освітленість становить близько 3000 лк, а більш висока пригнічує розвиток і може викликати опіки, викликані перегріванням і висиханням рослин. Водночас нестача світла може призвести до етіоляції (зменшення вмісту хлорофілу), витягування стебла, блокування реакцій фотоморфогенезу, зниження рівня цитокініну в коренях і, зрештою, до загибелі рослини. Також встановлено, що найчастіше вищезазначені рекомендації даються для окремого етапу або для всього процесу загоєння та мікровідтворення в цілому. Така комплексна оцінка не зовсім коректна, оскільки очевидно, що на етапі введення експланту в культуру та на етапі укорінення або мікро-
При різанні інтенсивність променистої енергії повинна бути різною. Відомо, що світлозалежна стимуляція росту тканин пов’язана з їх фотосинтетичною активністю [4]. Наявність листя визначає наявність безпосереднього зв'язку з процесом фотосинтезу. Тому світло використовується більш ефективно за рахунок архітектоніки рослини, фототаксису листкової пластинки і хлоропластів, а також за рахунок збільшення загальної площі останніх.
У зв’язку з цим вивчали можливість одержання якісних регенерантів із збереженням високої швидкості їх розмноження, використовуючи низьку інтенсивність освітлення (до 3000 лк) на етапах інтродукції, мікрозрізання та адаптації рослин до нестерильних умов.
Дослідження інтенсивності радіації на етапі введення експлантів у сорт Кристал показало, що найбільша кількість розвинених меристем спостерігалася при інтенсивності радіації 1800-2000 лк. Однак ці відмінності були насамперед пов’язані з кількістю рослин, що вижили після загибелі експлантів через відсутність розвитку та подальший некроз.
З огляду на викладене, найважливішим показником, що характеризує вплив організованих факторів, є відсоткове співвідношення кількості розвинених експлантів до кількості висаджених на живильне середовище наступного етапу культивування. Встановлено, що інтенсивність освітлення 1800-2000 лк забезпечувала 100% регенерацію меристем в досліді, а її зниження до 1300-1400 лк і 700-800 лк мало менш сприятливий вплив на меристеми (67 і 87% відповідно).
При вивченні параметрів інтенсивності радіації на стадії мікрочережки виявлено вплив сортоспецифіки на морфогенез рослин за різних умов освітлення. Так, для сортів Дружба, Цимлянський чорний і Ріхтер-110 найнижчим оптимальним порогом розвитку якісних рослин була освітленість 2900-3200 лк. За низької інтенсивності (900-1000 лк) спостерігалося подовження міжвузлів і зменшення діаметра пагона, тобто відбувалося зниження коефіцієнта потенціалу мікророзмноження. Для розвитку рослин сорту Квітковий сприятливою виявилася освітленість 1600-1700 лк, оскільки підвищення або
зниження інтенсивності спричиняло погіршення ростових характеристик і спостерігалося всихання верхівкової частини рослин.
Встановлено наявність адаптивної здатності рослин до умов енергетичного освітлення та при пересадці їх у нестерильні умови середовища. Як і очікувалося, зі зменшенням інтенсивності світлового потоку збільшувалася кількість листків, що формувалися, і площа листкової поверхні, що свідчить про пристосованість рослин до умов освітлення. У цьому досліді найкращою інтенсивністю для сортів Північне Каберне і Феркаль виявилася освітленість 1700-1900 лк; Допустима радіація 900-1000 люкс. Підвищення її до 2800-3100 лк погіршувало якість отриманих рослин.
Таким чином, значне зниження енергетичної освітленості до 1700-1900 лк, порівняно з рекомендованими різними авторами 8000-12000 лк, знижує енерговитрати, що в кінцевому підсумку значно знизить собівартість мериклонів.
Одним із світлових факторів, який має не менший вплив на розвиток рослин, ніж енергійне освітлення, є тривалість випромінювання. У більшості досліджень тривалість характеризується фотоперіодом, який визначається як кількість годин світла протягом доби.
У переважній більшості випадків для формування якісного врожаю рослин рекомендується фотоперіод 16 годин. Однак є дані про ефективність використання більш короткого фотоперіоду для сої, ячменю, огірків, картоплі, вишні, винограду [5, 6] і переривання нічного (темного) періоду спалахом світла.
Враховуючи зазначені напрями досліджень, а також те, що довгоденний фотоперіод може бути однією з причин генетичних відхилень, які виникають у процесі мікророзмноження, ми вивчили можливість заміни традиційного фотоперіоду 16 годин на більш короткий (16-1 і 14 годин), але не менше, ніж при природному освітленні (приблизно дорівнює 12 годинам).
В результаті встановлено, що для рослин сортів Цимлянський чорний і Феркал, які культивуються на етапі мікрочеренкування, доцільно змінити тривалість освітлення з 16 до 14 годин.
При фотоперіоді 16-1 год (переривання світлового періоду на годину темряви) значення показників розвитку достовірно не відрізнялися від значень, отриманих при освітленні протягом 14 год. Проте високий рівень забракованих пробіркових рослин, а саме більше половини висаджених на культивування, не дозволяє рекомендувати цей фотоперіод до використання. 12-годинний світловий день затримував розвиток надземних частин рослин сорту Феркал.
Що стосується якості світла (світла певного спектрального складу), то цей фактор освітлення є потужним засобом регуляції процесів росту, регенерації та ризогенезу in vitro. Слід зазначити, що якісний склад світла зазвичай виражають вмістом у ньому тих променів, які мають найбільшу фізіологічну дію на рослини. З усього спектру ФАР червоне і синє світло вважаються найактивнішими.
Зараз ми вивчаємо морфологічну реакцію винограду in vitro на опромінення рослин світлом різної якості (2004).
Одним із найбільш привабливих з практичної точки зору біотехнологічних прийомів є вплив на рослинний організм сигналів фізичної та фізико-хімічної природи в малих і наднизьких дозах, які мають різні механізми дії. У зв’язку з цим встановлено можливість отримання рослин-регенерантів у найкоротші терміни при використанні низької інтенсивності освітлення та екстремально низьких концентрацій фіторегулятора нового покоління емістиму, дія якого пов’язана із сильною спорідненістю фізико-хімічного потенціалу. Він містить близько 75 компонентів, завдяки яким цей гормон має ауксинову, цитокінінову та гіберелінову активність і є високоефективним індуктором стійкості рослин до вірусних захворювань. Оскільки емістим також може посилювати фотосинтетичну активність [7, 8], висунуто гіпотезу про взаємодоповнюваність впливів організованих факторів і за рахунок цього трансформацію невеликих кількостей енергії, що надходить від них у рослинний організм, у кількість, необхідну для збалансування гормонального статусу і, як наслідок, посилення ростових процесів.
Проте на етапах введення в культуру та укорінення взаємодії факторів не було, а от на етапі мікрочеренок сортів Цвєточний та Цимлянський чорний спостерігався позитивний зв’язок організованих умов. При цьому на значення досліджуваних показників більш істотно впливала інтенсивність освітленості, ніж емістим. Взаємодія факторів на мінливість досліджуваної ознаки становила від 7 до 87 %.
Отримані результати свідчать про те, що для оптимального розвитку обох сортів найкращими варіантами є 2200-2400 люкс + ЕМ 10-12 або 10-10%. У цих варіантах кількість загиблих від некрозу відбракованих мікрочерешок була незначною, а відсоток розвинутих рослин відносно вихідної кількості відповідно був одним із найвищих (70-85%), що свідчить про високу життєздатність отриманих мікроклонів.
Таким чином, при дуже малих витратах споживаної енергії спостерігається посилення ростових процесів і підвищення загального імунітету пробіркових рослин. Однак зниження інтенсивності світла при всіх досліджуваних концентраціях емістиму неприпустимо, оскільки воно тягне за собою гальмування або повну зупинку розвитку.
Необхідною вимогою методів мікророзмноження та створення генофондних колекцій є депонування (тривале зберігання) здорових рослин. Тому з метою зміни кінетики росту при депонуванні винограду in vitro досліджували спільну дію на морфогенез зниженої інтенсивності освітлення та інгібітора осмотичного росту маніту в живильному середовищі зберігання без зниження температурного оптимуму культивування (25–27 °С). Останнє дуже важливо, оскільки більшість досліджень використовують низькі температури для затримки розвитку рослин. Між тим, для цього потрібно мати спеціальне обладнання.
Експериментальні дані показали, що припущення щодо інгібуючої дії маніту в концентраціях 2; 4 і 6 мг/л на процеси росту винограду in vitro не підтверджено. Навпаки, маніт стимулював розвиток. Проте виявлено можливість збереження рослин без пересадки протягом 210-240 днів, використовуючи живильне середовище для тривалого зберігання і знижуючи освітленість до 400-500 лк, без зміни температурних параметрів.
Підсумовуючи, можна сказати, що дана робота з розробки світлобіотехнологічних методів дозволить значно знизити енергоємність методу оздоровлення та клонового мікророзмноження винограду, підвищивши при цьому якість рослин-регенерантів та зберігаючи високі показники їх розмноження.
Література
1 Лутова Л.А. Біотехнологія вищих рослин. - СПб.: Вид-во СПб. ун-та. 2003.-С. 212.
За матеріалами науково-практичної конференції «Адаптивне управління виноградарством (селекція, розсадництво, технології вирощування, виноробство)», Новочеркаськ, 19-23 квіт. 2004 рік
