Селекція винограду на безнасінність, великі ягоди та ранньостиглість на поліплоїдному рівні

Волинкін ​​В.А., доктор с.-г. наук, НІВіВ «Магарач»
Зленко В.А., науковий співробітник, кандидат с.-г. наук НІВіВ «Магарач»
Ліховська В.В., завідуюча сектором розсадника НІВіВ «Магарач»
       

Ефективність виноградарської галузі багато в чому залежить від вирощуваного сортименту.  Вирощування того чи іншого сорту в певних ґрунтово-кліматичних умовах суттєво впливає на ефективність землекористування, зрошення, застосування добрив, хімікатів та інших необхідних для вирощування агротехнічних заходів.
У всьому світі зростає увага до столового винограду без кісточок здоровий за дієтичною та поживною цінністю харчовий продукт, який користується високим попитом протягом року. Цю тенденцію неодноразово відзначали на Генеральних асамблеях Міжнародної організації винограду та вина.
Найбільш перспективним напрямком у селекції винограду для створення безнасінних сортів є поєднання в одному генотипі безнасінності зі стійкістю до несприятливих впливів зовнішнього середовища, хвороб і шкідників. Але сьогодні споживача також цікавить розмір ягід, розмір грона, колір і смак столового винограду, що в цілому визначає товарність продукції сорту. Попередніми дослідженнями встановлено, що ріст і лінійні розміри ягід корелюють з масою насіння в ягодах, оскільки гібереліни синтезуються в насінні, і чим більша маса насіння в ягодах, тим більше вони продукують і, отже, виростають більші ягоди [9]. Через існування такої закономірності безнасінних сортів винограду з ягодами більше 6 г поки що не отримано.
З іншого боку, в біології відома можливість існування фертильних рослин із збільшеним набором хромосом (поліплоїдів). Близько 45% видів рослин на Землі представлені поліплоїдами. Найцінніші культурні рослини, такі як пшениця, овес, арахіс, картопля, бруква, гірчиця, слива, суниця, ожина, тютюн, люцерна, тимофіївка, топінамбур, багаття, оливкове дерево, цукрова тростина та інші, є поліплоїдами [10].
Кожен вид рослинного і тваринного організму характеризується певним і постійним числом хромосом, яке в соматичних клітинах вдвічі більше (2n - диплоїд), ніж у зрілих статевих клітинах (n - гаплоїд). Варіації кількості хромосом у межах виду надзвичайно рідкісні [1].
Б. Р. Небель (1929) встановив диплоїдний набір хромосом (2n = 38) у видів V. vinifera, V. labruska, V. amurensis, V. coignite і V. doniana [12].
Однак у результаті порушення поділу клітин кількість хромосом може змінюватися.
Поліплоїдія пов'язана з багаторазовим збільшенням хромосом в ядрах клітин організму. Поліплоїдний ряд може бути представлений як збалансованим, так і незбалансованим типами числа хромосом. До перших відносяться 2n - диплоїд, 4n - тетраплоїд, 6n - гексаплоїд, 8n - октаплоїд, 10n - декаплоїд; до другої – 3n – триплоїдний, 5n – пентаплоїдний, 7n – гектаплоїдний, 9n – енаплоїдний набори хромосом. Рослинні організми з більшою плоїдністю зустрічаються рідше.
У поліплоїдних організмів часто збільшуються розміри репродуктивних органів (квіток, плодів і насіння), змінюються фізіологічні процеси, підвищується пластичність і стійкість до умов навколишнього середовища, що в кінцевому підсумку призводить до значного підвищення їх адаптаційного потенціалу. У тетраплоїдного винограду, як правило, більші грона і ягоди (вони часто раніші), а листя, пагони і загальний габітус рослини потужніші, ніж у диплоїдів, що свідчить про їх більшу життєздатність [11].
Перші тетраплоїдні форми винограду були створені Б. Р. Небелем, який при цитологічному дослідженні сортів виявив, що великоягідні клони Muskat gigas і Sultanina gigas містять подвоєне число хромосом у соматичному наборі (2n = 76), а у звичайних рослин тих же сортів 2n = 38 [12].
Про соматичну мутацію у сорті Sultanina (Kishmish white oval, Thompson Seedless) повідомив H. P. Olmo [13]. Автор зазначає, що великоягідні сорти цього сорту неодноразово виявлялися на каліфорнійських виноградниках. Всі вони відрізнялися від вихідного сорту збільшеним розміром грон, ягід, листя, товстими пагонами і вкороченими міжвузлями. У деяких вага одного грона досягала 2 кг, а середня вага ягід – 3,6 г. Найбільші ягоди важили 5 г, що майже вдвічі більше вихідного сорту.
У роботах H. P. Olmo повідомляється про нові тетраплоїдні форми винограду, виявлені серед крупноягідних японських сортів [14, 15].
Величезний внесок у цитогенетику винограду вніс С. Г. Топале. Він разом із командою співробітників проаналізував на хромосомне число понад 1000 сортів і клонів винограду з ампелографічних колекцій Молдавського НДІ Віерула та НДІ ім. Магарача. Виявилося, що переважна більшість сортів винограду мають у соматичному наборі 38 хромосом і, отже, є диплоїдами. Істинними тетраплоїдами з тетраплоїдним перициклом і соматичним числом хромосом 2n = 76 є тільки сорти Шасла Грос Кууляр рожева, Шасла Гроскуляр біла і Сажарет. Шасла діамантова, Шасла Бернардська і чотири клони - Рислінг великоягідний, Шабат великоягідний, Мускат олександрійський крупноягідний, Кишмиш білий великоягідний. - міксоплоїди. У міксоплоїдів під час макроспорогенезу в семязачатку утворюються два види макроспор, з яких у жіночому гаметофіті (зародковому мішку) утворюються два види гамет — гаплоїдні та диплоїдні яйцеклітини у співвідношенні приблизно 3:1. утворюються гаплоїдні (n = 19) і диплоїдні (n = 38). Однак, на відміну від жіночих гамет, диплоїдні та гаплоїдні чоловічі гамети зустрічаються з однаковою частотою [11].
У НІВіВ «Магарач» проводилась велика робота по гібридизації тетраплоїдних форм і диплоїдних сортів винограду. Для створення нових генотипів диплоїди були включені в гібридизацію шляхом схрещування диплоїдів з поліплоїдами; поліплоїди з поліплоїдами.  В результаті тривалої роботи отримано триплоїдний сорт Polyvitis Magaracha (3n = 57), батьківськими формами якого є Ката Курган і тетраплоїдний сорт Chaslas Gros Coulyar white.
Поряд з позитивними властивостями (наприклад, збільшенням розмірів грон і ягід) поліплоїди мають ряд небажаних властивостей. Основними з них є знижена плодючість, недостатньо висока продуктивність, а також низькі смакові якості. Відомо, що фертильність регулюється системою полігенів або генів-модифікаторів, які знаходяться в збалансованому стані у диплоїдів. Збільшення числа хромосом, мабуть, викликає порушення цього гармонійного балансу і, як наслідок, призводить до безпліддя. Неплідність насіння викликають також порушення фізіологічної рівноваги, аномалії утворення пилку, аномалії запилення, порушення росту пилкових трубок і запліднення. Відхилення від норми при мегаспорогенезі у поліплоїдів призводять до двох типів порушень – до запліднення, що призводить до «гаплоїдної стерильності», і після запліднення, що викликає аномальний розвиток ендосперму та ембріона – «зиготична стерильність» [5].
Триплоїди відрізняються високою стерильністю. У їх потомстві диплоїдні та анеуплоїдні форми з'являються в різних пропорціях. Це пояснюється дуже сильним порушенням мейозу внаслідок утворення тривалентів, а також наявністю одновалентних хромосом [3]. У безнасінного винограду також порушується процес запліднення.
Останнім часом багато цитогенетичних і селекційних лабораторій займаються експериментальним отриманням поліплоїдів. Методика цієї роботи дуже різноманітна: зміна температурних умов, використання іонізуючого випромінювання та всіляких хімічних (дія різних мутагенів) і механічних впливів (видалення верхівок пагонів, прищипування тощо). Найбільш успішні результати були отримані з використанням деяких хімічних речовин, таких як колхіцин, аценофтен і ін. Як би не відрізнялися всі перераховані реактиви один від одного, їх використання зводиться до впливу на механізм мітозу і мейозу з утворенням поліплоїдних клітин.
Поліплоїди можна отримати за допомогою хімічних речовин, які, надаючи наркотичну дію на мітотичний апарат (блокада веретена поділу), затримують розходження сестринських хроматид до протилежних полюсів клітини під час мітозу, внаслідок чого кількість хромосом подвоюється. Згодом із цієї тетраплоїдної клітини, яка набуває здатності до нормального поділу, утворюється тканина, потім пагін і органи розмноження.
Проте після обробки вегетативних органів рослин мутагенами та поліплоїдогенами, зокрема колхіцином, утворюється більш мозаїчна, у тому числі міксоплоїдна, рослина; рідше отримують периклінальні і секторні химери. В онтогенезі міксоплоїдних рослин частіше виникають химерні зміни і периклінальні химери. Згодом пагони часто «розміряються», але їх нижня частина складається з плоїдних тканин [6].
Є відомості про отримання поліплоїдних форм винограду з використанням колхіцину [2].
Існують різні способи отримання поліплоїдних форм. Серед них обробка насіння, обробка розсади в сім’ядольному стані, обробка пагонів укорінених живців (метод Дермена). Концентрація розчину колхіцину 0,12; 0,25 і 0,5% [7].
Кожна клітина організму реагує на колхіцин як самостійна одиниця. При застосуванні різних методів обробки великої кількості сортів колхіцином встановлено, що в залежності від генотипу та стану об’єкта по-різному відбувається як прояв мутацій, так і збереження мутагенного ефекту [5].
Відомо, що поліплоїдія не є повністю стабільною і в деяких випадках індуковані поліплоїди повертаються до диплоїдного стану. Плоїдність тканин часто змінюється в онтогенезі, що відзначається при повторних цитологічних дослідженнях оброблених рослин і при отриманні змін морфологічних ознак. Тетраплоїдні клітини діляться повільніше диплоїдних, тому відбувається поступове витіснення перших. Більшість видозмінених пагонів, досягнувши 20 см, дрібнішають, але нижня частина пагонів завжди має мутантні тканини.
Отримати тетраплоїдну рослину винограду, що на 100% складається з тетраплоїдних клітин, шляхом обробки вегетативних частин рослин і насіння колхіцином неможливо. Більшість дослідників, які створювали з його допомогою штучні поліплоїди найрізноманітніших культур, відзначають, що, як правило, утворюються химери, що складаються з диплоїдних і тетраплоїдних клітин і тканин, а не 100% поліплоїдів. Встановлено, що якщо перицикл складається з поліплоїдних клітин, то поліплоїдними є і генеративні органи рослини або окремого пагона - квітки і насіння. Рослини з поліплоїдним перициклом під час макро- і мікроспорогенезу в семязачатках і пиляках формують два типи макро- і мікроспор і, відповідно, статеві клітини - диплоїдні (n = 38) і гаплоїдні (n = 19) гамети, які в результаті запліднення призводять до утворення гетерогаметного потомства, що складається з дитри- і тетраплоїдних проростків. За дослідженнями Ш. Г, Топале, 100% тетраплоїдний виноград можна вирощувати тільки з насіння. Неможливо порівняти «сирі» мітотичні поліплоїди з мейотичними, отриманими шляхом гібридизації. [5].
Метою дослідження було одержання великоягідних поліплоїдних безнасінних форм винограду шляхом гібридизації материнських і батьківських форм, оброблених колхіцином, вивчення впливу колхіцину на формування бруньок винограду та формування міксо- та поліплоїдних форм, визначення фази розвитку обробки, підбір концентрації розчину, встановлення тривалості обробки для отримання поліплоїдних пагонів, суцвіть, диплоїдних і гаплоїдний гамети.
В досліді як вихідні використовували шість материнських гібридних форм (далі — ГФ) із функціонально жіночим типом квітки, три з яких мають у своєму генотипі безнасінні сорти.
Гібридна форма Лаура має дуже великі грона, дуже великі овальні, жовті ягоди. Консистенція ягід дуже м'ясиста; шкірка не відчувається під час їжі.
U g.f. Ягоди «Талісман» досягають ваги до 24 грамів. Ця форма має високу морозостійкість - 25 ºС, а також хорошу схожість насіння, до 40%, високу життєздатність розсади і передачу ознаки великоплідності ягід своїм гібридним нащадкам.
    На прикладі г.ф. Подарунок Запоріжжю отриманий в результаті гібридизації Талісман на Делайт, спостерігаємо передачу ознаки великоплідності ягід від вихідної материнської форми Талісман. Цей g.f. має підвищену стійкість до грибкових захворювань мілдью та оїдіуму.
    G.f. Лакомка рання отримана шляхом схрещування Талісман з безнасінним сортом Кишмиш променистий. У представленій формі простежується успадкування ознаки великоплідності ягід від вихідної материнської форми Талісман, що підтверджує вірогідність використання г.ф. Талісман як джерело донора великих плодів.
    Сорти Аркадія на Кишмиші променистому є вихідними батьківськими формами g.f. Прометей. У цьому потомстві спостерігаємо передачу безнасінним сортом Кишмиш променистий рожевого кольору ягід. Ця форма має яскраво виражений мускатний смак.
    G. f.Софія з того самого Аркадієвого роду на Кишмиші променистому. У нього також є рожеві ягоди, але не такі інтенсивні, як у Прометея. У цієї форми дуже великі витончені грона, дуже великі ягоди з мускатним ароматом.
З даних таблиці 1 видно, що основним принципом відбору вихідних форм є передача гібридному нащадку великоплідності ягід, розміру грона, ошатного забарвлення, а також різного строку дозрівання.
Таблиця 1. Коротка характеристика материнських початкових форм

На основі попередньо проведених схрещувань представлених г.ф. в потомстві Vitis vinifera отримують форми насіння, нестійкі до умов зовнішнього середовища, хвороб і шкідників. Тому переходимо до відбору вихідних батьківських безнасінних сортів, стійких до абіотичних і біотичних факторів.

Таблиця 2. Коротка характеристика батьківських шансів для схрещування за безнасінність

*- Номери кодів MOVV наведено в дужках

З таблиці 2 бачимо, що розміри грона у всіх форм коливаються від 5 до 9, за ступенем вираженості 9 балів – це дуже велике гроно (Kishmish radiata, Ялта). Ступінь стійкості листків проти мілдью майже у всіх міжвидових безнасінних форм становить 7 балів, де 9 балів — максимальна стійкість сортів.
Таким чином, в експерименті брали участь вихідні форми з найбільшими ягодами та ті, які стійкі до абіотичних і біотичних факторів і зарекомендували себе як донори високого ступеня вираженості цих ознак при передачі їх нащадкам. Застосування колхіцину має забезпечувати у вихідних форм гамети з подвійним набором хромосом, що, у свою чергу, при гібридизації дозволить отримати тетраплоїдні або триплоїдні гібриди, які матимуть збільшені розміри як ягід, так і грон. Застосування колхіцину при обробці бруньок вихідних материнських і батьківських форм з диплоїдним набором хромосом засноване на появі на диплоїдних кущах їх штучних поліплоїдів.
Для визначення відповідних строків і концентрацій застосування колхіцину у 2006-2008 рр. обробки бруньок проводили двічі: 1) під час їх цвітіння; 2) при формуванні в них генеративних органів. Для обробки використовували такі концентрації колхіцину в розчині H2O: 0,12; 0,25 і 0,5%. Розчин колхіцину наносили на ватний тампон, який накладали безпосередньо на нирку і обв'язували еластичним, водонепроникним, повітропроникним матеріалом. Тривалість обробки становила 7 днів і проходила в два періоди: від початку набрякання до розпускання бруньок і від початку до кінця цвітіння. Ідентифікацію міксоплоїдних пагонів зі змінами під дією колхіцину проводили за допомогою діагностичних морфологічних ознак.
У досліді з обробки бруньок колхіцином під час їх розпускання (дослід 1) у варіантах обробки 1 і 2 морфологічні характеристики пагонів, що розвиваються з оброблених бруньок, не відрізнялися від контрольного варіанту (без обробки).  Зміни пагонів і листя спостерігалися лише при обробці 0,5 % розчином колхіцину. Пагони мали потовщену форму з короткими міжвузлями. Листя сильно відрізнялися від контролю і мали гофровану форму, інтенсивного темно-зеленого кольору.  Розгалуження пагонів спостерігалося у двох вузлах над суцвіттям. Після розгалуження розвивалися пагони зі звичайною товщиною і довжиною міжвузлів, характерними для вихідної форми. Таким чином, отримані пагони до галуження в результаті обробки розчином колхіцину в концентрації 0,5 % за наведеними морфологічними ознаками відповідали поліплоїдним формам. За морфологічними ознаками роздвоєні пагони, ймовірно, були диплоїдними. На отриманих поліплоїдних пагонах формували суцвіття, які під час цвітіння використовували для гібридизації.
Отримані ягоди з г.ф. Талісман після обробки бруньок колхіцином під час формування в них генеративних органів (дослід 2) мав подовжену асиметричну форму, на відміну від злегка овальної форми ягід, властивої цьому г.ф. Отримано насіння, розміри якого значно варіювали. Насіння відрізнялося за формою, і якщо в контрольному насінні ми спостерігали витягнуту форму, то в досліді після обробки колхіцином відмічено більш округле, опукле насіння.  Отримане насіння висівали на гідропоніці, частина на живильне середовище в культурі in vitro, частина проростала і виростала розсада.
У 2008 році проведено цитологічне дослідження для підтвердження правильності обраного методу колхіцинації. Коли пагони з оброблених колхіцином бруньок досягли 2-4 см, їх зрізали і поміщали в фіксуючий розчин оцтового спирту на 12 годин. Закріплені пагони екстрагували з оцтового спирту і консервували в 70% спирті.
Цитологічний аналіз зареєстрованих пагонів проводився кафедрою фізіології рослин Таврійського національного університету в Сімферополі за участю спеціалістів (Бугара А. М., Теплицька Л. М., Бугара І. А.). Приготування барвника, фарбування та приготування препаратів проводили за методикою (Паушева З.П., 1988). На фотографії метафазної пластинки хромосом, отриманої з препарату G.F. Талісман показує, що кількість хромосом більше 50; точніше розрахувати не вдалося. На фотографіях зображені окремі хромосоми, але через глибину зразка хромосоми лежать у кількох площинах. Проте цитологічний аналіз та отримані фотографії підтверджують, що в результаті обробки колхіцином вдалося отримати міксоплоїдні форми винограду, які були використані при гібридизації.
Можна припустити, що нащадки також утворять поліплоїдні форми з більшими ягодами та гронами, ніж вихідні диплоїдні насіннєві та безнасінні сорти. Для остаточного висновку про те, що дійсно отримані гібриди з підвищеною кількістю хромосом і що вона буде зберігатися при вегетативному розмноженні, необхідно провести повторний цитогенетичний аналіз.