Товарів: 0
На суму: 0 грн
УДК 634.8:631.527:57.085.2
СТВОРЕННЯ СОРТІВ ВИНОГРАДУ ІЗ ПРИНЦИПІЛЬНО НОВОЮ ГЕНЕТИЧНОЮ СТРУКТУРОЮ НА ОСНОВІ МЕТОДІВ БІОТЕХНОЛОГІЇ
В. А. Волинкін, Є. Ш. Меметова, В.А. Данилейченко
Інститут винограду і вина «Магарач», Україна, м. Ялта
На основі аналізу проведених раніше досліджень показано можливість проведення ефективної гібридизації при схрещуванні форм винограду, що належать до різних видів підроду Euvitis роду Vitis, і неможливість отримання гібридних форм при схрещуванні форм винограду, що належать до різних родів родини Vitaceae. Проаналізовано можливість подолання цієї несхрещуваності за допомогою методу культури тканин in vitro та наведено результати перших досліджень щодо вибору середовищ і стадії розвитку ембріона для можливого отримання рослин винограду від міжродової гібридизації методом in vitro.
Розвиток фізіології рослин як галузі знань дав підстави припустити можливість використання загальних закономірностей при вирішенні конкретних питань сільськогосподарської практики, в тому числі селекції. Це повною мірою можна віднести до наукового розвитку селекції винограду.
Одним із напрямів розвитку фізіології рослин є пошук шляхів культивування рослин та їх органів у штучних умовах середовища in vitro, що, у свою чергу, передбачає перенесення селекції з рівня організму на рівень окремих органів, а потім і на молекулярний рівень.
Однак на даний момент селекція винограду, складного гетерозиготного організму, здійснюється на основі здійснення генеративної гібридизації. Але навіть при проведенні схрещувань традиційним методом виникає необхідність використання можливості культивування одного ембріона з насіння в умовах in vitro. Це пояснюється тим, що не завжди спостерігається висока сумісність двох схрещуваних форм, що пояснюється або низькою плодючістю, або генетичною неоднорідністю на хромосомному рівні, або специфікою розвитку ембріонів деяких материнських форм, що використовуються при схрещуванні. Класичним прикладом є отримання за допомогою культури тканин in vitro життєздатних плодоносних рослин винограду від схрещування двох безнасінних форм.
Однак перед селекцією винограду стоять інші проблеми, вирішення яких потребує використання біологічних досягнень у галузі культури тканин. Однією з таких проблем є отримання рослин від схрещування далеких з ботанічної точки зору форм винограду. За нашими дослідженнями успішно проводяться схрещування винограду в межах окремих видів і на міжвидовому рівні в межах підроду Euvitis роду Vitis. Експериментальні роботи, проведені у Франції і США по підбору пар, в першу чергу по пошуку різних материнських форм, дозволили отримати фертильні рослини шляхом схрещування форм винограду, що належать до різних підродів роду Vitis - Euvitis (види Vitis vinifera) х Muscadinia (види Vitis rotundifolia). Слід зазначити, що, за наявними даними, форми цих двох підродів винограду мають різну кількість хромосом.
Перехід у селекції винограду від використання вихідних форм, що належать до одного виду, до схрещування культурних форм, далеких з точки зору ботанічного та еколого-географічного походження, необхідний для отримання форм, а згодом і сортів, не тільки стійких до комплексу збудників, але й імунних до них.
Одним із напрямів селекційної програми, що формується на ІВіВ «Магарач», є отримання віддалених міжродових гібридів винограду на основі використання культури тканин in vitro.
Ці дослідження проводяться вперше з 2001 року. Проводиться підбір схрещених пар, визначаються етапи виходу ембріона із насіння після запліднення, підбираються та модифікуються середовища для культивування ембріона.
Для отримання нових сортів винограду, які поєднують у своєму генотипі ознаки високої врожайності з ознаками стійкості до збудників хвороб і абіотичних факторів навколишнього середовища, великий інтерес представляє залучення до селекційного процесу сортів, форм різних видів і пологів винограду, що володіють величезним генетичним потенціалом.
У свою чергу, можливе поєднання ознак різних батьківських форм в одному генотипі, якщо сумісність цих вихідних форм сприятлива. Це можна оцінити за двома параметрами: схрещуваністю вихідних форм і успадкованістю ознак у нащадків.
Природі успадкування окремих ознак присвячено досить велику кількість досліджень, у тому числі в IV&V «Магарач», які представлені в публікаціях [1-3]. Питання схрещування вихідних форм та ефективності гібридизації винограду мало вивчені, публікацій з цієї проблеми мало [4].
Спочатку історично схрещування винограду проводилося в межах виду Vitis vinifera. Сорти, взяті для схрещування, легко схрещувалися і виноградарі не звертали уваги на відмінності в ефективності при схрещуванні різних сортів цього виду між собою. З появою у виноградарстві проблеми філоксери виникла необхідність використовувати в схрещуваннях форми винограду з різних осередків походження врожаю, оскільки в результаті спільної еволюції збудників і рослини винограду утворювалися форми з генетично обумовленою стійкістю до цих збудників [5, 6]. Відповідно, необхідно було залучати до схрещувань форми з цих центрів, які мали необхідні характеристики.
Селекція винограду перейшла від рівня схрещування всередині одного виду до принципово нового рівня схрещування сортів і форм, що належать до різних сортів винограду. Була показана можливість схрещування форм винограду, що належать до різних видів підроду Euvitis роду Vitis [7], а пізніше була проаналізована ефективність таких різних схрещувань [8]. Для отримання гібридів винограду з більш віддалених за походженням вихідних форм ми проводили гібридизацію форм винограду, що належать до різних родів, але при традиційній генеративної гібридизації нам не вдалося отримати насіння.
Загалом у біології різні культури мають міжвидову та міжродову несумісність, обумовлену низкою причин, що перешкоджають нормальному функціонуванню біологічної структури. У винограду прояв таких закономірностей не виявлено на міжвидовому рівні, але вони виникли на міжродовому рівні. Однією з причин такого прояву несумісності є поява після запліднення через певний час так званої постгамної несумісності генотипів, ліквідованої на етапі ембріогенезу, при якій невідповідність між розвитком ембріона та дозріванням околоплодника викликає незавершене формування ендосперму, внаслідок чого ембріон гине [9, 10].
Метод ізольованих ембріонів у ранньому ембріогенезі є дуже перспективним для подолання постгамної несумісності рослин. Для подолання міжвидової та міжродової несумісності методом in vitro необхідно було визначити оптимальні терміни виділення ембріонів та методичні аспекти їх культивування.
В експерименті використовували такі комбінації хрестиків:
Через 20 днів після запилення і кожні наступні 10 днів отримані ягоди поверхнево стерилізували 42 % розчином хлорвмісного препарату (Белізна) і промивали стерильною водою протягом 5 хв. В асептичних умовах ягоди обробляли 70% етиловим спиртом протягом 5 хвилин, промивали стерильною водою, потім виділяли з них зачатки і насіння, які розділяли на дві частини. Зачатки та частину насіння з ендоспермом і зародком висаджували на рідкі та агаризовані поживні середовища з подальшим культивуванням у темряві при t = 24-27 °C. Було протестовано різні культуральні середовища:
Через 4-6 тижнів після експлантації ембріонів на середовища 1,2,3,4,5, пройшовши фазу дедиференціації, формувався первинний калюс із зачатків, отриманих у комбінаціях схрещувань: Vitis Longii x Parthenocisus; Vitis cinerea x Mogabi (сорт складного міжвидового походження); Vitis solonis x Vitis vinifera (сорт Vineyard Queen) і Vitis vinifera (сорт Aligote) x Vitis rupestris (сорт Rupestris du Lot).
Залежно від походження та умов вирощування калюс виявився дуже гетероморфним [11]. На середовищах 4 і 5 переважно утворювалися прозенхіматозні клітини, а на середовищах 1,2,3 – як прозенхіматозні, так і паренхіматозні клітини. Для отримання регенерантів щільний морфогенний калюс пересаджували на модифіковане середовище Мурасіге та Скуга та культивували при освітленні 1000 лк з 16-годинним періодом і t = 24-27 °C. Через 3-4 тижні ембріоїди отримували та пасували на модифікованому середовищі Мурасіге та Скуга. Відокремлений від ембріоїдів калюс також висівали на останнє середовище з ІУК у концентрації 0,05%, де знову утворювалися щільні калюсні зони.
Таким чином, калюс можна індукувати протягом тривалого часу, що дозволить виявити не тільки деякі особливості тривалого пасажу клітинних структур, а й використовувати для швидкого розмноження зразків. Отримані результати узгоджуються з опублікованими результатами інших дослідників [12].
Частини насіння з ендоспермом і зародком, виділені в різні терміни, від міжродових схрещувань Vitis Longii x Partenocisus, Ampelopsis cordata x Partenocisus висаджували на поживні середовища 1,4,5,7. Порівняльний аналіз показав, що через 4-6 тижнів на зазначених середовищах проростки отримували лише з насіння, ізольованого протягом 40-45 днів. При цьому максимальну кількість рослин було отримано на модифікованому нами середовищі Уайта. Для подальшого розвитку та стимуляції росту пагонів і коренів сіянці пересаджували та культивували на твердому модифікованому живильному середовищі Мурасіге та Скуга.
Таким чином, у результаті проведених досліджень і робіт з культивування на різних поживних середовищах найкращі результати отримано на модифікованому поживному середовищі Уайта, а оптимальною стадією виділення ембріонів є стадія їх розвитку на 40-45 добу.
При міжвидових схрещуваннях V.solonis x V. palmata, V.solonis x міжвидовий гібрид (Magarach Centaur), V. solonis x V.candicans отримано найбільшу кількість насіння. Оптимальним етапом їх ізоляції для отримання розсади є 55-75-й день. Причому при виділенні зародків на 55-ту добу сходи з'являлися на 35-56-у добу, а при виділенні зародків на 75-у добу сходи з'являлися на 19-ту добу.
Найменшу кількість насіння отримано у міжвидовій комбінації V.amurensis х міжвидовий гібрид (Центавр Магарач) та V.amurensis х міжвидовий гібрид (Ріслінг Магарач), які дали велику кількість стеноспермокарпічних, партенокарпічних ягід. Насіння цих гібридних комбінацій, висаджене на 50 і 75 день, проростало на 33-54 день. При схрещуванні V.amurensis x V.vinifera (мускат гамбурзький) запліднення виявилося невдалим. При міжродовому схрещуванні Ampelopsis cordata x Partenocisus inserfe Friisch оптимальним терміном ізоляції був 40-й день; сходи отримані на 8, 14 і 22 дні. Усі отримані проростки висаджували на модифіковане рідке живильне середовище Мурасіге та Скуга.
Триває культивування ембріонів різних комбінацій схрещувань. В даний час саджанці, які витримуються в культурі in vitro, отримані від схрещування форм винограду, що належать до родів Vitis (види Vitis vinifera) і Partenocissus.
Література
За матеріалами конференції: Сучасні досягнення біотехнології у виноградарстві та інших галузях сільського господарства, Новочеркаськ, 29-30 червня 2005 р. / ГНУ ВНІІВіВ ім. Я.І. Потапенко.
