Товарів: 0
На суму: 0 грн
Н.П. Дорошенка ДНУ ВНІІВіВ ім. Я.І. Потапенка Російської сільськогосподарської академії
Розглянуто сучасний стан двох напрямків сільськогосподарської біотехнології: генної та клітинної інженерії. Наведено результати досліджень з отримання здорового садивного матеріалу методом клонового мікророзмноження та збереження генофонду винограду in vitro. Відзначено перспективні напрями створення генетичного різноманіття для селекційної роботи.
Біотехнологія (біологічна технологія) включає два, здавалося б, несумісних поняття - промисловість і біологію. Найповнішу функцію біотехнології можна описати як цілеспрямоване перетворення речовини (і енергії) через організми.
Термін «біотехнологія» вперше використав угорець Карл Ерекі в 1919 році для позначення роботи, в якій продукти отримують з використанням живих організмів. У біологічному енциклопедичному словнику під біотехнологією розуміється використання живих організмів і біологічних процесів у виробництві. Європейська федерація біотехнології (EFB) визначає сучасну біотехнологію як використання природничих наук (біології, хімії, фізики) та інженерних наук (наприклад, електроніки) по відношенню до біосистем у біоіндустрії, а Європейська комісія (ЄК) доповнює її, щоб забезпечити біологічне співтовариство необхідними продуктами та послугами.
Останні два десятиліття 20 століття характеризуються видатними досягненнями в біотехнології, яка є міждисциплінарною галуззю знань, що базується на мікробіології, біохімії, молекулярній біології, біоорганічній хімії, біофізиці, вірусології, імунології, генетиці, інженерних науках та електроніці. Використання нових методів і значні успіхи фундаментальних досліджень другої половини 20 ст створили передумови для розвитку біотехнології.
Що таке біотехнологія? У світлі сучасних уявлень біотехнологія рослин – це поєднання методів культури клітин і тканин рослин з методами молекулярної біології та технологією рекомбінантних ДНК [1].
Культивовані клітини і тканини вищих рослин мають ряд унікальних особливостей, що відрізняють їх від клітин тварин і мікроорганізмів, що дозволяє їх широко використовувати. По-перше, їх можна вирощувати у вигляді неорганізованої клітинної маси (калюсу), здатної синтезувати видоспецифічні економічно важливі сполуки, і ними можна замінити рослинну сировину, отриману з рослин in vivo. По-друге, за бажанням експериментатора можна за допомогою простих маніпуляцій змусити ізольовані клітини утворювати рослини-регенератори. Вибравши як об’єкт інтегровану систему (зародки, апікальна меристема, пазушні бруньки), можна клонувати рослини, тобто отримувати рослини, ідентичні вихідним. Якщо ізольовані клітини або протопласти використовуються як об’єкт, то, ймовірно, виникнуть модифіковані варіанти, що створює різноманітність для селекціонера.
Усі нові клітинні технології можна розділити на дві групи: I - прискорення та полегшення традиційного процесу землеробства; II – створення генетичного різноманіття та можливість шляхом відбору на рівні соматичних клітин скринінгувати генотипи з важливими сільськогосподарськими ознаками [2]:
І група | ІІ група |
1. Екстракорпоральне запліднення | 1. Використання самоклональних варіантів |
2. Культура незрілих гібридних яйцеклітин і ембріонів (постгамна несумісність) | 2. Індукований мутагенез і селекція клітин на основі соматичної мінливості та індивідуального морфогенезу |
3. Регенерація рослин із тканин летальних гібридів | 3. Гібридизація соматичних клітин |
4. Експериментальна гаплоїдія | 4. Перенесення цитоплазматичних клітин |
5. Клональне мікророзмноження нових сортів, гібридів, ліній | 5. Генна інженерія - перенесення чужорідних генів |
6. Кріоконсервація генофонду | 6. Культури клітин як продуценти |
Біотехнологія поєднує два напрямки: клітинну та генну інженерію. Зі сказаного видно, що в процесі культивування можна проводити різні маніпуляції з клітинами і отримувати рослини з новими спадковими властивостями. Тому цей напрямок називають «клітинною інженерією». Генна інженерія – наука молодша; датою його народження вважається 1972 рік, коли була створена перша химерна молекула ДНК. Походження генної інженерії сягає корінням у розвиток молекулярної генетики та біохімії.
Стосовно сільськогосподарської біотехнології з використанням методів генної інженерії можна і потрібно вирішувати проблему створення нових і вдосконалених генотипів рослин і тварин з комплексною стійкістю до найнебезпечніших патогенів та інших шкідливих організмів, до абіотичних факторів середовища.
Ці технології, безсумнівно, прогресивні, але їх біологічна безпека ще недостатньо вивчена і становить небезпеку для всього живого на Землі. Провідні західні держави здійснюють жорсткий контроль за виконанням
трансгенних рослин у рослинництво, оскільки вони несуть нові біологічні ризики для агроценозу, які можуть негативно впливати на рослини, тварин і організм людини. У Росії, як і в інших країнах, прийнятий закон «Про державне регулювання генно-інженерної діяльності».
У всьому світі існує протидія генетично модифікованим харчовим продуктам (GMF). Прихильники сільськогосподарської біотехнології бачать у ній ключ до подальшого розвитку сільськогосподарських систем, які забезпечують більшу безпечність харчових продуктів, ніж сучасні системи з інтенсивним використанням хімікатів. Критики розглядають виробництво GMF як загрозу біорізноманіттю рослин і виживанню фермерів.
У США швидкими темпами розвивається сільськогосподарська біотехнологія. Проведено 400 польових випробувань трансгенних вірусостійких рослин. Однак про їх негативний вплив на навколишнє середовище не надходило. Наведено дані про польові випробування стійких до вірусів генотипів буряків, огірків, винограду, динь, вівса, папайї, гороху, перцю солодкого, картоплі, малини, сої, тютюну, томатів, кавунів, пшениці із зазначенням генів і донора стійкості до вірусів. Отримано дозвіл федеральних органів США на вирощування ряду трансгенних фенотипів цих культур у виробничих умовах.
На V Міжнародному симпозіумі розглядалися питання сільськогосподарської біотехнології та впровадження генетично модифікованих мікроорганізмів у виробництво Великобританії, Центральної та Східної Європи, Мексики, Китаю та Японії.
У статті Р. Гоца [3] розглядається ситуація з генною інженерією у виноградарстві та її перспективи на майбутнє. Зазначається, що над противірусною стійкістю винограду працюють робочі групи в Німеччині, Франції, Австрії, Швейцарії, Італії та США. Перевага генної інженерії перед класичною селекцією полягає в тому, що вона є більш цілеспрямованою та швидкою, а також меншою витратою та великим набором генів для маніпуляцій. Також ведуться роботи з протигрибкової стійкості винограду за допомогою генної інженерії.
Клітинна інженерія є одним із найважливіших напрямків у біотехнології. Він заснований на використанні принципово нового об'єкта - ізольованої культури клітин або тканин (вирощування ізольованих клітин і тканин на штучних поживних середовищах в стерильних умовах), а також на тотипотентності - унікальній властивості рослинних клітин. Використання цього об'єкта розкрило великі можливості у вирішенні глобальних теоретичних і практичних завдань.
Бурхливий розвиток клітинної інженерії припав на 50-ті роки минулого століття, хоча перші спроби виростити ізольовані шматочки тканини були зроблені набагато раніше. Справжній розвиток методу культури і клітин вищих рослин розпочався в 1932 році з праць французького вченого Р. Готре і американського дослідника Ф. Уайта.
Піонерами культури тканин винограду можна вважати французьких дослідників Г. Мореля, Л. Фалло, Р. Гальцу.
Г. Морель першим культивував тканину стебла винограду in vitro [4]. Згодом дослідження в області ізольованих тканин і органів винограду швидко розвивалися. Огляд наукових повідомлень про культуру органів, тканин і клітин винограду in vitro, зроблених А.І. Литвак та А.П. Кузьменко [5] показали широкі потенційні можливості методу. Сьогодні можна з упевненістю зробити висновок, що методи культивування органів, тканин і клітин in vitro займають міцне місце в арсеналі засобів, які зумовлюють значний прогрес у селекції винограду та у виробництві садивного матеріалу цієї давньої та широко поширеної культури.
У 1978 р. у відділі селекції і генетики Молдавського науково-дослідного інституту виноградарства і виноробства НВО «Віерул» (з ініціативи Н. І. Гузуна) розпочалися дослідження культури тканин.
У ВНІІВіВ «Магарач», у зв'язку з гострою проблемою прискореного розмноження нових сортів і клонів винограду, стійких до хвороб і шкідників, ранньостиглих, розроблена технологія прискореного розмноження винограду із застосуванням культури ізольованих тканин [6].
У Чечено-Інгушетії також була створена лабораторія клонового мікророзмноження, яка здійснювала практичне розмноження перспективних сортів винограду.
З ініціативи І.А. Кострикін і Б.А. Музиченко в 1983 році розпочав дослідження з культури тканин у Всеросійському науково-дослідному інституті виноградарства і виноробства ім. Я.І. Потапенка в лабораторії фізіології та біохімії рослин, яка потім була реорганізована в лабораторію біотехнології.
У лабораторії біотехнології ВНІІВіВ ім. Я.І. Потапенка у 2004 р. проводяться дослідження за напрямами: клонове мікророзмноження перспективних сортів винограду; оздоровлення садивного матеріалу від вірусів, мікоплазм, бактеріального раку; нетрадиційна селекція на безнасінність; створення in vitro колекцій генофонду винограду; вивчення анатомо-фізіологічних особливостей комбінацій прищепа-підщепа та розробка методів оцінки спорідненості in vitro.
Клональне мікророзмноження — принципово новий метод вегетативного розмноження, заснований на нестатевому одержанні рослин, генетично ідентичних вихідному зразку, в умовах in vitro. Метод заснований на унікальній здатності рослинної клітини реалізовувати властиву їй тотипотентність, тобто під впливом екзогенних впливів давати початок цілому рослинному організму. Цей спосіб має ряд переваг перед існуючими традиційними методами розмноження. Володіючи високоякісними матеріалами, високотехнологічним обладнанням та інструментами, ви можете отримати коефіцієнт відтворення 1: 20 000-60 000 за 8-10 місяців. На практиці реальна швидкість відтворення досягає кількох тисяч.
Велике значення для поліпшення вихідного рослинного матеріалу має метод клонального мікророзмноження. Загальновідомо, що боротьба з вірусними хворобами багатьох сільськогосподарських культур є однією з найактуальніших проблем рослинництва в усьому світі, оскільки цінні сорти рослин можуть вибувати з виробництва. Особливо гостро ця проблема стоїть для культур, що розмножуються вегетативно.
Вірусні захворювання винограду постійно знижують кількість і якість урожаю і є однією з причин раннього проріджування виноградників. Бактеріальний рак часто зустрічається у виноградниках і завдає їм значної шкоди.
Вірусні та бактеріальні захворювання винограду мають хронічний і системний характер, тому заражаються вегетативні нащадки хворих кущів. Найбільш небезпечним для розмноження є можливість латентного періоду розвитку цих хвороб, коли рослини переносять збудників без зовнішніх симптомів захворювання. Збір лози для розмноження з таких кущів призводить до вирощування хворих саджанців.
Основним способом захисту від вірусів є застосування профілактичних заходів. Це отримання здорового посадкового матеріалу і захист його від вторинного зараження.
Існує кілька способів отримання здорового посадкового матеріалу. Спосіб перший: відбір здорових кущів. Він складається з візуального відбору кущів, провокаційної проби на жилкову мозаїку, попереднього та основного тестування. Попереднє тестування проводиться за допомогою фітоіндикаторів, ІФА-тесту або ПЛР-аналізу. Остаточне випробування рослин, які досліджувалися зазначеними методами і дали негативну реакцію, проводять на сортах-індикаторах.
Рослинний матеріал, протестований на віруси, достовірно вільний лише від певних, найбільш поширених і небезпечних вірусів або вірусоподібних збудників, які природно присутні в виноградних насадженнях Російської Федерації.
Імпортний матеріал також повинен бути перевірений на наявність усіх вірусів, природно присутніх на винограді не тільки в Російській Федерації, але і за кордоном. Цей матеріал також повинен бути вільним від ряду інших небезпечних шкідників і хвороб, які важко знищити. Часто при імпорті садивного матеріалу завозяться сорти, не адаптовані до умов виноградарських регіонів РФ і не включені в Держреєстр, що призводить до загибелі вже посаджених виноградників.
Виявлено, що при насіннєвому розмноженні виноград передає віруси нащадкам, і сорти поступово обтяжуються тягарем вірусних інфекцій. Так, W. Hewitt [7] зазначає, що віруси, що передаються через ґрунт, мають дуже схожі фізичні властивості, схожі морфологічно, багато з них передаються через насіння. Вірус короткого вузла виявлено в насіннєвих оболонках і пилку [8]. Вчені також виявили, що виноградне насіння передає вірус кільцевої плямистості помідорів [9], вірус розеткоподібної мозаїки персика [10], латентний вірус болгарського винограду [11] і вірус тютюнової мозаїки [12]. Жовта плямистість винограду передається через пилок і насіння [13].
Крім того, основні сорти винограду характеризуються високим рівнем гетерозиготності, внаслідок чого їх насіннєве розмноження зі збереженням сортової чистоти практично неможливе.
При виробництві здорового садивного матеріалу найефективнішими є методи, об’єднані в систему біотехнологій. Формування банку здорових рослин здійснюється в результаті проведення системи оздоровчих заходів, що включають внутрішній і зовнішній карантин, тестування, знезараження, розмноження in vitro, прижиттєву адаптацію, створення маточників, комплексний захист від хвороб і шкідників.
Садивний матеріал, вільний від усіх відомих вірусів і вірусоподібних захворювань винограду (Virus free), можна отримати, використовуючи культуру апікальних меристем з відносним розміром ізольованих експлантів від 0,1 до 0,25 мм (базовий матеріал класу А).
Меристематичні тканини зазначеного розміру виділяють в асептичних умовах під бінокулярним мікроскопом при 25-кратному збільшенні з бруньок пагонових бруньок у період активного росту кущів винограду або з зимуючих бруньок і висаджують на живильне середовище.
У зв’язку з тим, що регенераційна здатність таких експлантів низька (не перевищує 10,0%), удосконалено схему регенерації рослин, яка складається з таких послідовних етапів:
Запропонована схема регенерації рослин із меристем включає оптимізацію всіх етапів клонального мікророзмноження від входу в культуру до мікрозрізання, а також адаптацію здорових рослин до нестерильних умов.
Доведено перевагу поживного середовища Мурасіге і Скуга в порівнянні з середовищем Готре і Хеллера. На різних етапах регенерації та клонового мікророзмноження рослин винограду необхідна його модифікація. При тривалому культивуванні ризогенна зона та надземна частина пробіркових рослин краще розвиваються на модифікованому середовищі Мурасіге та Скуга зі зниженою кількістю макроелементів. Зменшення вмісту ІУК у живильному середовищі до 0,1 мг/л покращує приживлюваність мікрозрізів, співвідношення розвитку ризогенної зони та надземної частини рослин (коефіцієнт полярності), утворення більшої кількості листків, а також кращий розвиток рослин при субкультивації. Для сортів винограду Алан1, Агат Донський, Восторг, Ромулус, Русмол можлива заміна цього живильного середовища на живильне середовище Лі і де Фоссара, що забезпечує більш інтенсивний розвиток рослин. Це дозволяє скоротити терміни підготовки до адаптації до 30 днів, а повторні мікрорізки проводити через 45 днів.
Уточнено вміст цитокініну 6-БАП на кожному етапі культивування, вивчено можливість використання препаратів Bi і B2, розроблено метод підвищення регенераційної здатності меристем шляхом впливу на них електромагнітного опромінення низької інтенсивності (мікрохвильові промені) у поєднанні з вузькосмуговим лазером, перспективи використання фітодобавки з дрібно подрібнених кісточок винограду та нових. фіторегулятор емистим.
Встановлено, що оптимальний вміст 6-БАП у живильному середовищі на першому та другому етапах введення меристем у культуру для більшості сортів становить 1,0 мг/л.
Ефективність препаратів В1 і В2 вибіркова залежно від сортових особливостей. Поліпшення репаративної та продуктивної регенерації меристем при внесенні їх у живильне середовище було найбільш ефективним для сортів Сибірковий і Русбол, менш ефективним – для сортів Віолетовий ранній і Рупестріс дю Лот, що не дозволяє рекомендувати їх для широкого використання.
Доведено, що сумісна дія мікрохвильових променів і лазера сприяє прискореному проходженню фаз розвитку меристем, збільшенню розмірних характеристик, знижує їх загибель внаслідок некрозу тканин і, як наслідок, забезпечує підвищення регенераційної здатності меристем у 5,5 рази.
При додаванні в живильне середовище препарату емістим завдяки широкому спектру дії покращується виживаність меристем на обох етапах внесення. Поліпшується проліферація: новоутворення вузлів і пагонів, зрізання пагонів для вкорінення і подальшого мікророзмноження. Так, у сорту Дружба виживаність меристем на першому етапі зросла з 56,1 до 81,2%, на другому з 39,0 до 46,8%, продуктивне відновлення зросло в 3,5 раза.
Оптимізації клонального мікророзмноження на етапі мікрочержень пробіркових рослин сприяє використання мікрохвильових променів, рослинної добавки з дрібно подрібнених кісточок винограду та внесення в живильне середовище 6-БАП. Під впливом мікрохвильових променів добова швидкість росту збільшується в 1,7-2,4 раза, маса рослини в 2 рази, довжина пагона в 1,7 раза, кількість утворених вузлів в 1,2-1,5 раза. При додаванні в живильне середовище природних стимуляторів росту з кісточок винограду ефективність клонального мікророзмноження підвищується на 27,4%.
У процесі досліджень розроблені методи, спрямовані на покращення регенерації рослин: стерилізація початкових експлантів, боротьба з хронічною інфекцією, оптимізація поживних середовищ, підвищення регенераційної здатності меристем із зимуючих бруньок, оптимізація самого етапу мікророзмноження у важкорозмножуваних сортів винограду, адаптація рослин до нестерильних умов.
Для комплексного оздоровлення рослин від вірусів, вірусоподібних хвороб і мікоплазм розроблено метод водолікування визрілих мікрочерешок з подальшим культивуванням верхівкових меристем. Уточнено режими обробки з метою забезпечення приживлюваності, продуктивного відновлення та оздоровлення ряду сортів винограду: Степняк, Сапераві північний, Цвєточний, Фіалковий ранній, Запашний, Московський стійкий.
Результати дослідження фітогормону емістим свідчать, що цей препарат позитивно впливає на ріст меристематичних тканин, ростові процеси пробіркових рослин, зменшує вплив несприятливих і стресових факторів, підвищує стійкість до патогенів. Виробничі випробування, проведені на сорті Північне Каберне, показали, що завдяки емістиму адаптація пробіркових рослин до нестерильних умов покращується на 95-100%.
Таким чином, розроблено методи підвищення регенераційної здатності меристем і, як наслідок, ефективності оздоровлення рослин винограду від вірусної інфекції, що підтверджено тестуванням на трав’яних індикаторах та методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).
Спосіб адаптації здорових пробірних рослин винограду до нестерильних умов включає вибір субстрату, відбір рослин певних розмірів, обробку рослин і субстратів та реалізацію процесу адаптації на стелажах прискореного розмноження рослин (APPR).
Основні маточники зі здорового садивного матеріалу можна висаджувати на ділянках, віддалених від звичайних посадок винограду на відстані не менше 1000 м. Щоб уникнути вторинного зараження, здорові рослини висаджують у грунт, вільний від нематод – переносників вірусів і збудника бактеріального раку. Такими вважаються ґрунти, на яких виноград не вирощувався 10-12 років, а зернові культури вирощувалися останні 3-5 років.
Розроблені такі способи закладання маточника:
Розроблена технологія посадки маточників із здорового садивного матеріалу випробувана в плівкових, стаціонарних теплицях і відкритому грунті в ряді виноградарських господарств Дону. Доведено можливість і досить високу ефективність такого способу створення сортових маточників основного садивного матеріалу.
В даний час розпочато роботу зі створення сучасного розсадницького центру на піщаних землях Ростовської області (Нижньо-Кундрюческій філіал дослідного поля) для виробництва вітчизняного сертифікованого посадкового матеріалу, вільного від хронічних хвороб і карантинного шкідника філоксери.
Пріоритетним напрямком адаптивної селекції ХХІ століття є збереження природного генетичного різноманіття рослин. Ідеальною альтернативою або доповненням до польового збору є зберігання винограду in vitro, у вигляді вирощування колекцій періодично субклонованих рослин.
У нормальних умовах культивування зберігання in vitro є трудомістким процесом, оскільки через 2-2,5 місяці потрібні регулярні пересадки на свіже живильне середовище, що потребує великих трудових і фінансових витрат. Необхідно було розробити методи зберігання, щоб змінити кінетику росту рослин і збільшити часовий інтервал між пересадками. Для цього розроблено методи зберігання при низьких плюсових температурах і освітленості з використанням інгібіторів росту та осмотичного росту, природних регуляторів росту.
У результаті ми запропонували нові умови тривалого зберігання генофонду винограду: до 10-12 місяців і більше без пересадки за рахунок використання модифікованого для зберігання поживного середовища Мурасіге і Скуга, температура 4 °С і освітленість 0,3-0,5 тис. люкс.
Вперше природні інгібітори були використані для осадження рослин винограду. Додавання до живильного середовища виноградних кісточок у підвищених концентраціях (1,0 % тонко подрібненого порошку насіння або 20 % водного екстракту) створює в ній такий рівень природних інгібіторів, при якому спостерігається уповільнення ростових процесів і вдається збільшити часові інтервали між пересадками рослин на свіже живильне середовище в 4-5 разів.
Розроблено технологію створення генофонду винограду in vitro, яка включає:
Перелік можливих, але ще на різних стадіях розвитку, біотехнологічних методів дуже великий. Дослідження, спрямовані на те, щоб зробити доступним для громадськості метод отримання регенерантів з мозолі, прогресували відносно добре. У процесі отримання ембріонів і регенерантів з калюсної тканини можна впливати на організм, що розвивається, шляхом зміни компонентів середовища. Використання селективних середовищ дає змогу вже на стадії калюсної тканини або суспензійної культури відібрати клітини, стійкі до високих рівнів солей або гербіцидів, толерантні до грибкових, бактеріальних токсинів або самих патогенів.
Значний інтерес представляють технології отримання гаплоїдних організмів через культуру пиляків, коли регенерація пагонів відбувається з гаплоїдної спорогенної тканини.
Метод in vitro дає можливість провести штучне зараження та оцінити стійкість проростків на обмеженій кількості матеріалу без ризику втрати вихідного зразка.
Метод мікроклонального розмноження може бути використаний при фізіологічних, біохімічних і фітопатологічних дослідженнях сільськогосподарських рослин. Метаболічні процеси, пов'язані із синтезом білків, жирів, вуглеводів, амінокислот і ін., а також механізми, що забезпечують стійкість рослин до хвороб і комах-шкідників, можна більш повно і точно вивчити при використанні ліній з однаковою генетичною основою.
Таким чином, можна стверджувати, що метод мікророзмноження відіграватиме важливу роль не лише в клітинній інженерії, а й у практичній реалізації основних напрямків генної інженерії в рослинництві.
Література
За матеріалами науково-практичної конференції «Адаптивне ведення виноградарства (селекція, розсадництво, технології вирощування, виноробство», Новочеркаськ, 19-23 квітня 2004 р.
